【摘要】： 牙齒組織工程中局部誘導(dǎo)微環(huán)境的建立主要是通過支架材料或單因子誘導(dǎo)的方式,來促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的分化。由于牙齒發(fā)育的微環(huán)境異常復(fù)雜,涉及到上皮-間充質(zhì)相互作用以及多種基質(zhì)成分、礦物離子、生長因子的參與,單純依靠支架材料或某幾種生長因子等非生理誘導(dǎo)方式局限性較明顯,不能滿足組織工程化牙齒的形態(tài)發(fā)生要求。本研究擬通過模擬牙髓干細(xì)胞的體內(nèi)生長發(fā)育環(huán)境,以重組微環(huán)境的方式來調(diào)控牙髓干細(xì)胞的分化和形態(tài)發(fā)生,并在此基礎(chǔ)上,嘗試?yán)醚浪韪杉?xì)胞研制同種異體“嵌合體牙齒”,以期為組織工程化牙齒最終的臨床應(yīng)用探尋一條新的研究途徑。 所取得的主要研究結(jié)果如下: 1組織工程化牙齒異位再生環(huán)境的篩選和驗證 比較了出生后4 d的封閉群SD仔鼠磨牙牙胚器官,在同種異體宿主體內(nèi)不同部位的生長發(fā)育情況,結(jié)果表明腎被膜下的牙胚發(fā)育狀況接近正常;進(jìn)一步將相關(guān)的牙齒組織塊移植至腎被膜下,同樣生長發(fā)育良好;單獨將牙乳頭細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行腎被膜下移植,可以形成牙尖樣的牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體。另外,我們還比較了傳代前、后的牙胚細(xì)胞團(tuán)在腎被膜下構(gòu)建組織工程化牙齒的可行性,結(jié)果表明:原代牙胚細(xì)胞團(tuán)體內(nèi)可發(fā)育成典型的牙胚樣結(jié)構(gòu),而第二代牙胚細(xì)胞團(tuán)僅形成極少量的釉質(zhì),覆蓋在牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體表面。 上述結(jié)果證實腎被膜下環(huán)境有利于牙胚及其相關(guān)組織、細(xì)胞的繼續(xù)生長發(fā)育。在腎被膜下的生長環(huán)境中,出生后的牙乳頭細(xì)胞、牙胚細(xì)胞可分別再現(xiàn)牙齒間充質(zhì)、牙胚早期的發(fā)育模式,說明牙齒形態(tài)發(fā)生所需的遺傳信息是儲存在離散后的單個牙源性細(xì)胞中的。 2牙胚細(xì)胞誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞分化的實驗 為了驗證牙胚細(xì)胞所提供的發(fā)育微環(huán)境是否適合成體牙髓干細(xì)胞的增殖、分化,本實驗通過三種不同的培養(yǎng)方式:牙胚細(xì)胞條件液、分層培養(yǎng)、混合培養(yǎng),觀察牙胚細(xì)胞對牙髓干細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。結(jié)果顯示:牙髓干細(xì)胞在與牙胚細(xì)胞條件液培養(yǎng)、分層培養(yǎng)的情況下,可向功能性成牙本質(zhì)細(xì)胞譜系分化,誘導(dǎo)分化后的牙髓干細(xì)胞團(tuán)移植至腎被膜下,形成了規(guī)則的牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體結(jié)構(gòu)。而牙胚細(xì)胞與牙髓干細(xì)胞混合培養(yǎng)方式不能提供了良好的促增殖、促分化的誘導(dǎo)環(huán)境,以致誘導(dǎo)后的牙髓干細(xì)胞不能形成典型的牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體。 上述結(jié)果提示牙胚細(xì)胞與牙髓干細(xì)胞非接觸式培養(yǎng)時,所提供的可溶性信號分子,有利于牙髓干細(xì)胞的牙向分化、牙本質(zhì)形成;而接觸式培養(yǎng)條件下牙胚細(xì)胞分泌的胞外基質(zhì)蛋白以及不溶性表面分子,可能對牙髓干細(xì)胞的增殖起抑制作用,進(jìn)而影響了其牙向分化的可持續(xù)性。 3牙髓細(xì)胞對牙髓干細(xì)胞增殖分化的影響 為驗證來自成體牙髓細(xì)胞的微環(huán)境能否促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的增殖、分化,本實驗采用酶消化法結(jié)合組織塊法,獲取原代牙髓細(xì)胞,與STRO-1+的牙髓干細(xì)胞以三種方式:條件液、分層培養(yǎng)、混合培養(yǎng)進(jìn)行共培養(yǎng)。結(jié)果表明:缺少上皮信號的成體微環(huán)境不能有效地誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞的牙向分化和形態(tài)發(fā)生,但可明顯促進(jìn)其增殖活性。提示成體微環(huán)境中缺少促進(jìn)牙髓干細(xì)胞牙向分化的啟動信號,但成體微環(huán)境中生長因子、細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞表面分子等對牙髓干細(xì)胞的促增殖效應(yīng)明顯。 4用牙髓干細(xì)胞制備嵌合體牙齒 為進(jìn)一步驗證牙胚細(xì)胞的誘導(dǎo)作用是來自其中的上皮還是間充質(zhì)成分,本實驗將取自不同個體的大鼠切牙根尖蕾細(xì)胞、牙乳頭細(xì)胞分別與STRO-1+牙髓干細(xì)胞復(fù)合形成細(xì)胞團(tuán)重組體,腎被膜下移植,結(jié)果顯示根尖蕾細(xì)胞-牙髓干細(xì)胞嵌合體在體內(nèi)形成典型的牙冠樣結(jié)構(gòu);牙乳頭細(xì)胞-牙髓干細(xì)胞嵌合體形成的含骨樣牙本質(zhì)和牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體的結(jié)構(gòu)中,PKH26標(biāo)記的牙髓干細(xì)胞并未直接參與成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和牙本質(zhì)形成,說明在牙胚細(xì)胞誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞牙向分化過程中,是牙源性上皮成分起了決定性作用。 在與非牙源性STRO-1+骨髓基質(zhì)干細(xì)胞嵌合成牙的比較研究中,我們發(fā)現(xiàn):根尖蕾細(xì)胞能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞譜系分化,但根尖蕾細(xì)胞-骨髓基質(zhì)干細(xì)胞重組體在腎被膜下,僅發(fā)育成不典型的牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體,無釉質(zhì)形成。提示在嵌合體牙齒研究中,牙源性成體干細(xì)胞比非牙源性成體干細(xì)胞更具有臨床應(yīng)用價值。 當(dāng)牙髓干細(xì)胞與根尖蕾細(xì)胞按不同比例進(jìn)行體內(nèi)重組時,我們發(fā)現(xiàn):上皮細(xì)胞與牙髓干細(xì)胞的比例可影響嵌合體牙齒的形態(tài)發(fā)生,只有在1:1細(xì)胞比情況下,才會形成典型的牙冠樣結(jié)構(gòu)。 綜上所述,盡管不同的重組微環(huán)境對牙髓干細(xì)胞分化和形態(tài)發(fā)生的影響各不相同,但其規(guī)則的形態(tài)發(fā)生離不開牙源性上皮信號的誘導(dǎo),從根本上講,仍離不開上皮-間充質(zhì)的相互作用。利用這一發(fā)現(xiàn),本研究成功地用牙髓干細(xì)胞構(gòu)建出嵌合體牙胚樣結(jié)構(gòu)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R78
【圖文】：

圖 1.3.5 RT-PCR 檢測 Dspp 基因的表達(dá)1，Marker；2，細(xì)胞團(tuán)；3，單層細(xì)胞；4，β-actin；5，β-actin細(xì)胞團(tuán) DSPP（圖 1.3.4C）、DMP-1（圖 1.3.4D）免疫染色的細(xì)胞呈陰性表達(dá)（圖 1.3.4E、F）。RT-PCR 顯示細(xì)胞團(tuán)表達(dá)，對照組則無表達(dá)（圖 1.3.5）。究表明：細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)時的三維立體環(huán)境，可促進(jìn)牙乳頭細(xì)胞譜系分化，但由于細(xì)胞團(tuán)內(nèi)部營養(yǎng)不足，細(xì)胞增殖極慢。因胞團(tuán)如用于體內(nèi)移植實驗時，其體外培養(yǎng)時間不宜超過3 組織學(xué)分析植物取材結(jié)果顯示：對照組的牙乳頭組織分化形成了典型的體，牙本質(zhì)小管、髓腔結(jié)構(gòu)清晰（圖1.3.6C、D）。實驗組有m×2 mm×2 mm（圖1.3.6A、B）、牙尖樣的牙本質(zhì)牙髓復(fù)合E、G），這些移植物中成牙本質(zhì)細(xì)胞、前期牙本質(zhì)、牙本質(zhì)

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文傳代1次。用TGC條件液誘導(dǎo)4 d后，原本多形態(tài)分布的DPSC呈現(xiàn)柱狀伸長現(xiàn)象，有長的細(xì)胞突起，趨于平行排列，個別細(xì)胞有單個胞漿突起（圖2.1.1B）。7d時，出現(xiàn)更多的長梭形緊密排列的細(xì)胞（圖2.1.1D）。對照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)7 d沒有明顯的形態(tài)學(xué)改變（圖2.1.1C）。B

【參考文獻(xiàn)】

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1 郭紅延,吳補(bǔ)領(lǐng),郭希民,楊成,徐蓬,王常勇;重建牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)的實驗研究[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2005年06期

2 包柳郁,金巖,史俊南,牛忠英,汪平,王捍國;人牙源性間充質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)的實驗研究[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2005年05期

3 包柳郁,金巖,史俊南,牛忠英,汪平,趙守亮,郝建軍,王捍國;用人牙源性上皮和間充質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建組織工程化牙齒樣結(jié)構(gòu)的實驗研究[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2004年11期

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5 陸群,吳補(bǔ)領(lǐng),王冀姝,韓驊,周學(xué)東;Notch信號分子于小鼠牙髓干細(xì)胞樣細(xì)胞表達(dá)的研究[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2004年01期

本文編號：2725686