【摘要】：因外傷、腫瘤、先天性畸形等造成頜骨缺損的修復(fù)一直是困擾口腔頜面外科臨床醫(yī)生的難題。頜骨缺損一方面造成功能障礙，另一方面造成美觀問(wèn)題，加重患者的心理負(fù)擔(dān)。隨著社會(huì)的進(jìn)步和發(fā)展，交通事故的發(fā)生機(jī)會(huì)也越來(lái)越多，頭面部損傷和頜骨骨折的發(fā)生率呈增高趨勢(shì)�，F(xiàn)代戰(zhàn)爭(zhēng)中，面部缺乏防護(hù)，頜面部現(xiàn)代戰(zhàn)傷發(fā)生率超出10%。因此，有關(guān)頜骨骨缺損修復(fù)的研究也一直是基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。 骨缺損的修復(fù)中，神經(jīng)系統(tǒng)在其中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)介質(zhì)在修復(fù)的啟動(dòng)、成骨和后期改建中均發(fā)揮重要作用，有許多細(xì)胞因子參與這一過(guò)程。分子生物學(xué)研究表明，骨折愈合是一個(gè)多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子參與調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，這其中既有骨缺損周圍成骨相關(guān)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子作用，也有遠(yuǎn)端相關(guān)器官通過(guò)體液轉(zhuǎn)運(yùn)而來(lái)的各種激素和調(diào)節(jié)因子，還有神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)神經(jīng)末梢釋放出的神經(jīng)遞質(zhì)參與其中。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophicfactor； neurotrophic factors，NTF)的一種，也是骨缺損周圍成骨相關(guān)細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子。研究表明，NGF對(duì)骨缺損愈合過(guò)程起著重要的調(diào)節(jié)作用。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)作為重要的感覺(jué)神經(jīng)信號(hào)分子，因在骨折愈合調(diào)控中的重要作用而受到廣泛關(guān)注。NGF與CGRP都與骨缺損愈合過(guò)程相關(guān)，并且國(guó)內(nèi)外諸多研究發(fā)現(xiàn)CGRP和NGF骨折區(qū)的含量均增多。而且都與支配骨組織的神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)聯(lián)，不同在于NGF是神經(jīng)靶細(xì)胞分泌，被神經(jīng)末梢攝取的，CGRP是神經(jīng)末梢釋放的，作用于靶細(xì)胞的。這兩者在骨愈合過(guò)程中的相互關(guān)系如何？有沒(méi)有相互之間的調(diào)節(jié)機(jī)制？ 基于以上想法，并結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，本課題首先制備可以在骨缺損區(qū)域持續(xù)釋放NGF的緩釋微球，研究下頜骨骨缺損愈合過(guò)程中NGF對(duì)支配下頜骨的三叉神經(jīng)節(jié)中CGRP的合成與分泌的影響。利用藥劑學(xué)技術(shù)，制備單甲氧基聚乙二醇聚乳酸神經(jīng)生長(zhǎng)因子[(mono-methoxy poly (ethylene glycol)-poly(lactic acid)-nerve growth factor，mPEG-PLA-NGF]緩釋微球，檢測(cè)微球的包封率、載藥量等理化性質(zhì)，研究緩釋微球國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)30973334）；重慶市自然科學(xué)基金（CSTC2009BB5334）的體外釋放規(guī)律。利用PC-12細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)微球釋放NGF的生物活性和臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。制備大鼠下頜骨骨缺損模型，通過(guò)全身注射或局部應(yīng)用NGF緩釋微球干預(yù)骨愈合過(guò)程，檢測(cè)大鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)NGF、CGRP、TrkA(tyrosine kinase A，絡(luò)氨酸激酶A)等的變化，探討下頜骨骨缺損愈合過(guò)程中NGF對(duì)神經(jīng)節(jié)的作用。原代培養(yǎng)大鼠的成骨細(xì)胞，并進(jìn)行形態(tài)觀察和鑒定，用不同濃度的CGRP刺激成骨細(xì)胞，觀察CGRP對(duì)成骨細(xì)胞合成NGF的影響 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果： 1、 mPEG-PLA-NGF緩釋微球的制備及體外釋放實(shí)驗(yàn)研究 mPEG-PLA-BSA微球的制備預(yù)實(shí)驗(yàn)：取三種不同配比的單甲氧基聚乙二醇聚乳酸(mono-methoxy poly (ethylene glycol)-poly(lactic acid)，mPEG-PLA)(mPEG：PLA分別為1:4，1:10，1:20的3種mPEG-PLA，其中mPEG分子量均為5000。)用復(fù)乳法制備微球，通過(guò)篩選，選用mPEG：PLA=1:20的mPEG-PLA。用復(fù)乳法制備mPEG-PLA-NGF緩釋微球，觀察微球的表面形態(tài)，微球表面光滑圓整，球體大小較均勻。微球平均粒徑為74.2±21.3μm，粒徑分布范圍較窄。載藥量和包封率的實(shí)驗(yàn)表明，mPEG-PLA-NGF緩釋微球包封率為(77.3±1.81)％。載藥量為[(2.13±0.24)×10-5]%。微球的體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，微球在14d內(nèi)，不僅一直持續(xù)釋放神經(jīng)生長(zhǎng)因子，而且所釋放出的神經(jīng)生長(zhǎng)因子濃度可以保持在一定的水平：(54.67-76.81) fmol/μL，平均濃度為(65.74±11.07) fmol/μL。經(jīng)檢測(cè)表明，神經(jīng)生長(zhǎng)因子緩釋微球的24h內(nèi)釋放量為27.36％，21d后釋放度達(dá)72.34％。NGF緩釋系統(tǒng)中釋放的NGF活性測(cè)定試驗(yàn)中，通過(guò)PC-12細(xì)胞的出芽情況證明了mPEG-PLA-NGF緩釋微球可以持續(xù)釋放出有生理活性的NGF。 2、神經(jīng)生長(zhǎng)因子在下頜骨骨缺損愈合過(guò)程中對(duì)骨折愈合的促進(jìn)作用以及對(duì)三叉神經(jīng)節(jié)合成降鈣素基因相關(guān)肽的影響 建立大鼠下頜骨骨缺損動(dòng)物模型，分為：①空白組：只手術(shù)，不給藥；②對(duì)照組：手術(shù)后，NGF腹腔給藥；③實(shí)驗(yàn)組：手術(shù)時(shí)，局部涂布mPEG-PLA-NGF緩釋微球。分別在術(shù)后1w，2w，4w，8w處死動(dòng)物。術(shù)區(qū)標(biāo)本HE染色顯示，mPEG-PLA-NGF實(shí)驗(yàn)組的骨痂生成量和骨痂成熟度要明顯高于對(duì)照組和空白組，而且愈合時(shí)間明顯提前。四環(huán)素?zé)晒馊旧Y(jié)果顯示，mPEG-PLA-NGF實(shí)驗(yàn)組可加快大鼠新生骨的形成，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 建立大鼠下頜骨骨缺損動(dòng)物模型，分為：①單純骨缺損組，不給藥；②單純?nèi)斫o藥組，不手術(shù)；③骨缺損+全身給藥組；④骨缺損+NGF微球；⑤空白組。在術(shù)后第1d，2d，3d，7d處死動(dòng)物，獲取三叉神經(jīng)節(jié)標(biāo)本，并通過(guò)免疫組化法，檢測(cè)三叉神經(jīng)節(jié)中NGF、CGRP、TrkA的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，各組均觀察到三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)NGF、CGRP、TrkA表達(dá)有所增強(qiáng)，第2組最不明顯，第4組表達(dá)顯著高于其他組。3天達(dá)到最高，以后逐漸下降，但仍高于兩對(duì)照組。三項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果極為相似，顯示出密切的相關(guān)性。 3、降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)成骨細(xì)胞分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子的影響 原代培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞，并進(jìn)行了形態(tài)觀察和鑒定。用不同濃度的CGRP刺激成骨細(xì)胞，在第1，2，3，5d，用ELISA法測(cè)不同濃度CGRP對(duì)大鼠成骨細(xì)胞上清液中NGF濃度的影響。結(jié)果顯示成骨細(xì)胞自身可以產(chǎn)生少量的NGF，在CGRP作用下，可以明顯上調(diào)成骨細(xì)胞分泌的NGF，而且隨CGRP濃度升高，此作用也相應(yīng)增強(qiáng)。此外，成骨細(xì)胞上清液中NGF的濃度隨CGRP作用后時(shí)間延長(zhǎng)也增加。 結(jié)論： 1、以mPEG-PLA為載體，采用復(fù)乳法(w/o/w)制備的mPEG-PLA-NGF緩釋微球具有良好的物理和生化性能，能夠持續(xù)釋放具有生物活性的神經(jīng)生長(zhǎng)因子。 2、實(shí)驗(yàn)采用的微球制備方法和工藝確實(shí)可行，并具有一定的實(shí)用性。通過(guò)中國(guó)、美國(guó)、歐盟、日本等專利檢索，“一種生長(zhǎng)因子緩釋微球及其制備方法”具有原創(chuàng)性，已經(jīng)獲得了中國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)局技術(shù)發(fā)明專利(專利號(hào)： ZL201110027337.8)。 3、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明骨缺損區(qū)域的NGF能夠促進(jìn)大鼠下頜骨骨缺損的愈合，促進(jìn)大鼠的三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞合成CGRP。 4、體外研究表明CGRP對(duì)成骨細(xì)胞NGF的表達(dá)有促進(jìn)作用，并與劑量和時(shí)間呈正相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R782.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2723755