【摘要】： 背景與目的: 齲病是一種發(fā)病率很高的疾病,現(xiàn)代病因?qū)W認(rèn)為齲病是一種細(xì)菌感染性疾病,其發(fā)生與多種因素有關(guān),其中牙菌斑在牙面的形成是齲病發(fā)生的先決條件。大量的研究表明在牙菌斑的形成及致齲過程中變形鏈球菌起著至關(guān)重要的作用,被認(rèn)為是主要的致齲菌。變形鏈球菌在牙面的粘附、聚集是其致齲作用首要的和關(guān)鍵的一步,也是最為重要的一步。因此通過主動或被動免疫的方法來封閉、失活變形鏈球菌菌體表面參與粘附和聚集的毒力因子,阻止變形鏈球菌在牙面的粘附聚集從而降低其致齲力,一直是齲病免疫預(yù)防研究的焦點。近年來,隨著基因治療的飛速發(fā)展,防齲DNA疫苗的研究也成為齲病防治領(lǐng)域的熱點。在前期的研究中我們已經(jīng)成功地構(gòu)建了載有與變形鏈球菌最初附著有關(guān)的表面蛋白抗原AgⅠ/Ⅱ的唾液結(jié)合區(qū)段(Saliva-binding region,SBR)基因的雙啟動子表達載體pCN-SSIE(含真核啟動子CMV和原核啟動子Nir),和載有變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶葡聚糖結(jié)合區(qū)(Glucan-binding region,GBR)基因的表達載體pTriEx-4-GBR,且證實了它們的免疫原性。本實驗的目的是構(gòu)建載有SBR和GBR基因的二價雙啟動子表達載體pCN-SSISG。并檢測其在原核細(xì)胞減毒沙門氏菌SL3261中的表達情況以及以減毒沙門氏菌為DNA疫苗載體通過口服在動物小鼠體內(nèi)免疫的情況。 方法: 根據(jù)GenBank公布的S.mutans glucosyltransferase(gtfB and gtfC)genes基因序列(序列號M17361)設(shè)計一對特異性引物,上游引物5′端含有限制性內(nèi)切酶HindⅢ位點;下游引物5′端含有XhoⅠ的酶切位點。利用PCR技術(shù)從載有變形鏈球菌gtfB基因的質(zhì)粒中擴增葡聚糖結(jié)合區(qū)段(GBR)的基因片段,然后將合成的組織纖溶酶原信號肽序列(tPA-SP)連接到GBR基因的上游,再將此基因(sGBR)定向克隆到載有sSBR基因的雙啟動子表達載體pCN-SSIE上,構(gòu)建出pCN-SSISG.。通過酶切分析和DNA測序證明雙啟動子表達質(zhì)粒pCN-SSISG構(gòu)建成功后,再用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒沙門氏菌SL3261,并用轉(zhuǎn)化子口服免疫小鼠;同時利用在前期研究中已構(gòu)建好的原核表達載體pTriEx-4-SBR和pTriEx-4-GBR在大腸桿菌JM109(DE3)中分別誘導(dǎo)表達抗原蛋白SBR和GBR,并應(yīng)用HisTrap~(TM)蛋白純化試劑盒純化后,皮下免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體,酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)和Westemblotting檢測pCN-SSISG在原核細(xì)胞減毒沙門氏菌SL3261中表達SBR和GBR蛋白的情況,和以減毒沙門氏菌為載體在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的全身及粘膜免疫反應(yīng)情況。 結(jié)果: 通過對重組質(zhì)粒pCN-SSISG的酶切鑒定以及DNA序列測定分析,證明重組表達載體pCN-SSISG構(gòu)建成功、開放閱讀框架正確;SDS-PAGE表明在減毒沙門氏菌SL3261中pCN-SSISG能正常表達目的蛋白,其條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符,Western blot也檢測到了SBR和GBR蛋白的表達。這些結(jié)果表明質(zhì)�？梢栽谠思�(xì)胞中正常工作。同時用ELISA間接法和Western blotting檢測口服免疫小鼠的血清抗體,結(jié)果顯示制備的小鼠血清能特異地結(jié)合在原核細(xì)胞中表達及純化的SBR和GBR融合蛋白,酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)結(jié)果顯示:在以減毒沙門氏菌為載體口服免疫的小鼠血清及唾液中,都檢測到了明顯高于對照組的高水平的抗SBR和GBR特異性抗體IgG、IgA。 結(jié)論: 本實驗利用PCR、T-A克隆等分子生物學(xué)技術(shù)成功地將編碼SBR及GBR的基因定向克隆到表達載體pCMVnir上,構(gòu)建出了一個新的特別適合以減毒沙門氏菌為載體的二價雙啟動子DNA疫苗pCN-SSISG;它在原核細(xì)胞中能夠良好地表達,且能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng),為進一步的實驗研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R78
【圖文】：

將擴增后的GBR目的片段克隆蛋白胞外分泌的組織型纖溶酶原信號膚序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒pTriEx一4一SG，轉(zhuǎn)化篩選后酶條約5000bP的條帶，信號膚序列的長度為GBR片段的5‘端，構(gòu)建成sGBR。最后別用BamHI、Xhol雙酶切，回收目的和載N一ssISG。BamHI、乃01雙酶切電泳表明，bp，與預(yù)期相符。序列測定結(jié)果證明GBRtansglueosyltransferase(gtfBandgtfC)genes切鑒定結(jié)果如圖1:

到0.3~0.6時，加入IPTG至終濃度IITunol/L繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達5小時后，取同時培養(yǎng)的陽性克隆未誘導(dǎo)組以及JM109(DE3)空白組菌液lml進SDS一PAGE電泳比較，結(jié)果如圖。

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