【摘要】：研究背景與目的組織工程是近年來正在興起的一門前沿學(xué)科,對于容易造成軟硬組織缺損的疾病來說,組織工程技術(shù)能夠為已缺損或喪失的組織重建新的有功能的結(jié)構(gòu),從而備受關(guān)注。種子細(xì)胞的選取對于組織工程來說至關(guān)重要,選擇一種具有優(yōu)越的自我更新和多向分化能力的干細(xì)胞,決定著“再生”這一過程的成敗。近年來,多種口腔組織來源的成體干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)使口腔組織再生邁出了關(guān)鍵的一步。迄今為止,已有多種牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞被分離及鑒定,這些干細(xì)胞可來自牙髓、牙周膜、根尖乳頭、脫落乳牙、發(fā)育中的牙囊、牙齦組織。在這眾多的細(xì)胞之中,牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells,DPSCs)、牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)和牙齦干細(xì)胞牙齦干細(xì)胞(gingival MSCs,GMSCs)是三種最容易獲取的牙源性干細(xì)胞,且其組織來源能夠一次性地從同一個體獲得(例如需要切開牙齦拔除的阻生智齒),因此本實驗的前部分致力于在體外詳盡地比較同一供體來源的這三種牙源性干細(xì)胞不同傳代次數(shù)下的性能,為它們各自性能的優(yōu)化提供思路,為口腔組織工程種子細(xì)胞的選取提供策略。此外,在組織再生過程中,宿主局部微環(huán)境在很大程度上影響著組織再生的效果,鑒于骨組織工程的應(yīng)用更加成熟廣泛,針對上述三種牙源性干細(xì)胞中成骨能力最強的干細(xì)胞,進(jìn)一步了解其在炎癥微環(huán)境下成骨能力的變化及相應(yīng)的機制也至關(guān)重要。細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是一種內(nèi)毒素,作為Gram陰性菌外膜的主要成分,被普遍認(rèn)為是口腔微環(huán)境中的一個有害因子。但特定濃度下的LPS對成體間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化性能的影響尚無明確定論,有些認(rèn)為抑制,而有些認(rèn)為促進(jìn)。因此本實驗的后半部分重點在于探究細(xì)菌脂多糖對牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力的影響及可能的作用機制。材料與方法1.利用酶解組織塊法分離、培養(yǎng)原代DPSCs、PDLSCs與GMSCs;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測三種牙源性干細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物,利用成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)檢驗三種牙源性干細(xì)胞的多向分化潛能;進(jìn)行三種間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代、凍存、復(fù)蘇,獲得三種細(xì)胞的第四代(P4)和第11代(P11)的細(xì)胞。2.利用CCK-8技術(shù),EdU核酸標(biāo)記技術(shù)檢測三種細(xì)胞不同傳代次數(shù)(P4及P11)下的增殖能力,利用β-半乳糖苷酶染色技術(shù)檢測三種細(xì)胞在P4及P1]的衰老情況,利用Annexin-V-APC染色技術(shù)檢測三種細(xì)胞在P4及P11的凋亡,利用ALP染色技術(shù)、ALP活性檢測技術(shù)、茜素紅染色技術(shù)檢測三種細(xì)胞在P4及P11的成骨分化能力,利用油紅O染色技術(shù)檢測三種細(xì)胞在P4及P11時的成脂分化能力;利用qRT-PCR技術(shù)檢測干性相關(guān)mRNA(c-MYC,NANOG,KLF4,OCT4)的表達(dá)水平、成骨分化相關(guān)mRNA(ALP、RUNX2、Coll等)的表達(dá)水平;利用Western Blot技術(shù)檢測細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞成骨分化等相關(guān)蛋白及增殖成骨相關(guān)信號通路核心蛋白的表達(dá)。3.利用重組慢病毒技術(shù)敲低牙周膜干細(xì)胞中TAZ(transcriptional activator with a PDZ motif)的表達(dá),探究TAZ在LPS所導(dǎo)致的PDLSCs成骨分化能力變化中的作用;利用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑DKK-1探究經(jīng)典Wnt信號通路在此過程中的作用。實驗結(jié)果1.成功分離培養(yǎng)出了同一供體來源的原代DPSCs、PDLSCs與GMSCs,并穩(wěn)定傳代至P4及P11;三種牙源性干細(xì)胞均具有自我更新能力,表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面標(biāo)記物,并可以成骨、成脂、成軟骨(至少三系)分化,滿足間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。2.將不同代數(shù)的三種細(xì)胞進(jìn)行增殖、衰老、干性維持、凋亡、成骨向分化、成脂向分化等性能的綜合對比,結(jié)果顯示:相較于其他兩種細(xì)胞,GMSCs表現(xiàn)出優(yōu)異的增殖能力,而PDLSCs表現(xiàn)出優(yōu)異的成骨向和成脂向分化能力,DPSCs在這增殖及分化這兩個方面表現(xiàn)居中。此外,GMSCs受長期體外傳代的影響最小,而PDLSCs則最易受體外傳代次數(shù)的影響而最容易衰老。三種細(xì)胞的生物學(xué)性能在長期體外培養(yǎng)后都受到一定程度的負(fù)面影響。3.大腸桿菌來源的LPS(0.5 μg/mL)不影響PDLSCs的增殖但可促進(jìn)其成骨分化,其促成骨的過程與TAZ的上調(diào)密切相關(guān),而TAZ的上調(diào)又受到經(jīng)典Wnt信號通路的調(diào)控。實驗結(jié)論及意義三種牙源性干細(xì)胞在體外均具有自我更新和多項分化潛能,其中PDLSCs更適合于骨組織再生,但其應(yīng)用需控制在一定代數(shù)之內(nèi);對于GMSCs,在應(yīng)用過程中想辦法提高其分化能力至關(guān)重要。在微量LPS的刺激下,PDLSCs的成骨能力不降反升,而這種成骨能力的增強受TAZ及經(jīng)典Wnt信號通路的調(diào)控。
【圖文】：

染液沒過細(xì)胞，染色５－３０邋ｍｉｎ。④清洗。ＰＢＳ溶液清洗細(xì)微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)及脂滴含量。⑥掃描記錄。將染色后的留記錄。逡逑化：成軟骨分化采取小球培養(yǎng)方法，將細(xì)胞置于成軟骨誘管中懸浮培養(yǎng)，４周后對成軟骨分化誘導(dǎo)產(chǎn)生的小球組織進(jìn)行阿新蘭染色，之后于顯微鏡下觀察。逡逑果逡逑ｓ、ＤＰＳＣｓ、ＧＭＳＣｓ的原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)逡逑１０－１４天的生長，于顯微鏡下觀察可見三種細(xì)胞的原代細(xì)胞均，形狀為長梭形（圖１－１）。在經(jīng)歷較少次數(shù)的體外傳代后，呈現(xiàn)光滑一致的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞較為密集時呈旋渦歷較多次數(shù)的體外傳代后，，ＰＤＬＳＣｓ的Ｐ１１細(xì)胞形態(tài)稍有改大，表現(xiàn)出刺狀凸起（圖卜１）。逡逑Ｐ0邐Ｐ４邐Ｐ１１逡逑

２．２ＰＤＬＳＣｓ、邋ＤＰＳＣｓ、邋ＧＭＳＣｓ表明標(biāo)志物的檢測逡逑利用流式細(xì)胞儀檢測三種牙源性干細(xì)胞（Ｐ３）的表面標(biāo)志物。結(jié)果如圖所示逡逑（圖１－２），三種牙源性干細(xì)胞均陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物，陰性逡逑表達(dá)造血及上皮細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物。具體表達(dá)量為：①ＰＤＬＳＣｓ：逡逑ＣＤ９０＝９９＿７±０．２２％、ＣＤ４４＝９９．７±０．１７％、ＣＤ１０５＝９９．６±０．３２％、ＣＤ７３＝９９．８士邋０．１１％、逡逑ＣＤ３４＋ＣＤ１１６＋ＣＤ１９＋ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＝２．０３士０．４３％邋（圖邋１－２邋Ａ）。②ＤＰＳＣｓ：逡逑ＣＤ９０＝９９．５±０．３６％、ＣＤ４４＝９９．７±０．２５％、ＣＤ１０５＝９９．８±０．１５％、ＣＤ７３＝９９．７±０．２４％、逡逑ＣＤ３４＋ＣＤ１１６＋ＣＤ１９＋ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ二邋１．３７士０．５６％邋（圖邋１－２邋Ｂ）。③ＧＭＳＣｓ：逡逑ＣＤ９０＝９９．６土邋０．３２％、ＣＤ４４＝９９．９±０．１３％、ＣＤ邋１０５二９９．６±０．２９％、ＣＤ７３＝９９．８±０．２３％、逡逑ＣＤ３４＋ＣＤ１１６＋ＣＤ１９＋ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＝２．７６士０．３８％邋（圖邋１－２邋Ｃ）。此外邋ＳＴＲＯ－１邋在逡逑ＰＤＬＳＣｓ、ＤＰＳＣｓ、ＧＭＳＣｓ邋中的表達(dá)量分別為邋３７．７±０．１７％、２６．２±０．１４％、２１邋±０．１１邋％。逡逑Ａ邋邐邋邐邋邐．邐．逡逑＾，邋Ｉ邋．邐邐邐Ｊ邋Ａ邋＇ｃ0３？ｃ0１ｉｓ？＇邐ｈ逡逑0邐ＣＤＳＯ，丨邐，邐ｎ０５邐，邐咖＊”，邐，邋ＣＯ＾ＭＳ．邐ｉ逡逑＾邋ＪＪ邋＼一邋ｌ邋＼Ｊ＼邋—邋Ｊ．邋Ｊ邋ａ＿＾邋ｋ二＆：逡逑■
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R78

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本文編號：2707837