【摘要】：目的:牽張成骨(distraction osteogenesis,DO)是一種截骨后對帶血管蒂的骨塊進行持續(xù)牽張,進而牽張間隙中有新骨形成的骨再生過程。除了骨再生過程,血管形成過程對于牽張成骨同樣不可缺少。三七總皂苷(panax notoginseng saponins,PNS)是傳統(tǒng)中藥三七的有效活性成分,課題組前期發(fā)現(xiàn)PNS可促進牽張成骨的成骨過程,且在牽張區(qū)域檢測到內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)表面標記物的高表達,我們推測PNS對牽張成骨過程中的血管形成也有一定影響,故在此研究中,我們在體外實驗運用含不同濃度PNS的培養(yǎng)基培養(yǎng)犬骨髓來源EPCs,研究適宜濃度PNS是否會對EPCs的功能產(chǎn)生影響,及適宜濃度PNS是否會活化內(nèi)皮祖細胞上的Wnt信號通路,為進一步在體內(nèi)實驗研究PNS對牽張成骨過程中血管形成過程的影響奠定基礎(chǔ)。方法:1.犬EPCs的分離培養(yǎng)、功能鑒定及PNS對EPCs生物學(xué)特性的影響:首先運用密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁法對犬EPCs進行分離培養(yǎng),運用免疫熒光鑒定EPCs表面標記物,遷移實驗檢測EPCs的遷移功能,成管實驗檢測EPCs的成管能力,免疫熒光檢測EPCs VEGF、bFGF的表達;再運用CCK-8增殖實驗檢測不同濃度PNS對EPCs增殖的影響;運用細胞遷移實驗檢測不同濃度PNS對EPCs遷移能力的影響;運用PCR檢測不同濃度PNS對EPCs VEGF、bFGF基因水平表達的影響;運用免疫組化檢測不同濃度PNS對EPCs表達VEGF的影響,免疫熒光檢測不同濃度PNS對EPCs表達bFGF的影響。2.PNS對內(nèi)皮祖細胞Wnt信號通路活化的影響:先運用PCR檢測不同濃度PNS對Wnt信號通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、負性調(diào)控蛋白GSK-3β及下游靶基因cyclin D1的基因水平表達的影響;再運用免疫組化和Western Blot檢測不同濃度PNS對Wnt信號通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、負性調(diào)控蛋白GSK-3β及下游靶基因cyclin D1蛋白表達的影響。結(jié)果:1.犬EPCs的分離培養(yǎng)、功能鑒定及PNS對EPCs生物學(xué)特性的影響:倒置顯微鏡下觀察到原代EPCs成簇生長,剛貼壁時呈圓形,后來呈長梭形、多角形、紡錘形;免疫熒光結(jié)果顯示EPCs表達CD133、CD34;細胞遷移實驗中,Transwell小室上室種入EPCs后,24小時后可在下室觀察到細胞的遷移,48小時后可見遷移增多;基質(zhì)膠成管實驗中,6小時后可觀察到EPCs在基質(zhì)膠中形成“管腔”樣結(jié)構(gòu);免疫熒光結(jié)果顯示EPCs表達VEGF、bFGF;CCK-8增殖實驗結(jié)果顯示PNS濃度在低于或等于6.25mg/L時可促進EPCs增殖,高于6.25mg/L時,則可能會對EPCs的增殖產(chǎn)生抑制;細胞遷移實驗結(jié)果顯示6.25mg/L、12.5mg/L的PNS均可促進內(nèi)皮祖細胞的遷移,6.25mg/L的PNS更能促進EPCs遷移(P0.05);PCR結(jié)果顯示6.25mg/L、12.5mg/L的PNS均可上調(diào)內(nèi)皮祖細胞VEGF、bFGF基因水平的表達(P0.05),6.25mg/L的PNS更能上調(diào)內(nèi)皮祖細胞VEGF、bFGF基因水平的表達(P0.05);免疫組化和熒光的結(jié)果顯示6.25mg/L、12.5mg/L的PNS均可促進內(nèi)皮祖細胞VEGF和bFGF的蛋白表達(P0.05),6.25mg/L的PNS更能促進內(nèi)皮祖細胞VEGF和bFGF的蛋白表達(P0.05);2.PNS對內(nèi)皮祖細胞Wnt信號通路活化的影響:PCR、免疫組化、WB結(jié)果顯示6.25mg/L、12.5mg/L的PNS均可上調(diào)Wnt信號通路關(guān)鍵蛋白β-catenin及下游靶基因cyclin D1的基因和蛋白水平的表達(P0.05),6.25mg/L的PNS更能上調(diào)β-catenin及cyclin D1的基因及蛋白水平的表達(P0.05);6.25mg/L、12.5mg/L的PNS均可下調(diào)Wnt信號通路負性調(diào)控蛋白GSK-3β的基因及蛋白水平的表達(P0.05),6.25mg/L的PNS更能下調(diào)GSK-3β的基因及蛋白水平的表達(P0.05)。結(jié)論:1.適宜濃度的PNS可促進內(nèi)皮祖細胞的增殖,遷移能力,及VEGF、bFGF的表達;2.PNS可通過上調(diào)Wnt信號通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、下游靶基因cyclin D1的表達,下調(diào)Wnt信號通路負性調(diào)控蛋白GSK-3β的表達參與Wnt信號通路的活化。
【圖文】：

圖 1-1 內(nèi)皮祖細胞形態(tài)（A、D：呈紡錘形，，長梭形 B：呈“線性排列” C：呈簇狀生長;A,B,C,D×100）Fig.1-1 Morphology of Endothelial progenitor cells (A, D: spindle-shaped, long-fusiform B:"lineararrangement" C: clustered growth; A,B,C,D×100)

CD34的表達(A:CD34;B:DAPI;C:Merge;A,B,C×100)
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R783.5

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本文編號：2706029