發(fā)布時間：2020-06-08 07:45

【摘要】： 目的通過體外培養(yǎng)獲得人牙周韌帶細(xì)胞(human periodontal ligament cells,HPDLCs),并通過觀察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)對HPDLCs增殖及分泌腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、白細(xì)胞介素-β(interleukin-1β,IL-1β)以及白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)的影響,觀察LPS作用HPDLCs后核轉(zhuǎn)錄因子-kB(nuelearfactor kappa B,NF-kB)的表達(dá)情況,探討LPS在牙周炎發(fā)病過程中的作用,為尋找預(yù)防和藥物治療牙周炎的新途徑提供理論依據(jù)。 方法收集12-28歲因正畸拔除的健康前磨牙60例,采用組織塊直接貼壁培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)HPDLCs,并行人牙周韌帶細(xì)胞來源鑒定。將HPDLCs分為兩組,即實(shí)驗(yàn)組和對照組:分別置于含有不同濃度LPS(實(shí)驗(yàn)組:0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml及100μg/ml;對照組0μg/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后,MTT法檢測HPDLCs增殖情況。選用10μg/ml的LPS作用HPDLCs 24h后,分別檢測LPS作用HPDLCs前后其堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性。選用10μg/ml的LPS刺激HPDLCs,并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)分別檢測LPS刺激前及刺激3h、6h、24h、48h后細(xì)胞上清液中TNF-α、IFN-γ)、IL-1β、IL-8的表達(dá)情況。選用10μg/ml的LPS刺激HPDLCs 24h,用免疫熒光法檢測LPS刺激前后HPDLCs中NF-kB的表達(dá)情況。多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05,結(jié)果以P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.體外培養(yǎng)HPDLCs60例,成功15例,成功率為25%。經(jīng)免疫組化染色顯示所培養(yǎng)細(xì)胞抗角蛋白染色陰性,抗骨橋素(osteopontin,OPN)染色陽性,證明細(xì)胞非上皮來源,并具有成骨特性。 2.低于1μg/ml濃度的LPS可促進(jìn)HPDLCs的增殖,其中促進(jìn)作用最為明顯的濃度為0.01μg/ml(P0.05),隨著濃度的增加促進(jìn)作用逐漸下降;LPS濃度達(dá)到10μg/ml和100μg/ml時對HPDLCs增殖則無影響(P0.05)。 3.LPS作用24h后HPDLCs的ALP活性明顯下降(P0.01)。 4.LPS刺激HPDLCs 3h后即可檢測到TNF-α、IFN-γ以及IL-1β分泌量均明顯升高(P0.05),并隨作用時間延長逐漸升高,到24h達(dá)到高峰;隨后三種細(xì)胞因子分泌量均逐漸下降,至48h時IFN-γ和IL-1β仍維持一較高水平(P0.05),而TNF-α分泌量則恢復(fù)至刺激前水平(P0.05)。LPS刺激HPDLCs3h和6h檢測IL-8的分泌受到明顯抑制(P0.05),隨后才出現(xiàn)時間依賴性增加,直至24h后IL-8分泌量才高于刺激前水平,到48h達(dá)到頂峰(P0.05)。 5.LPS作用前免疫熒光檢測NF-kB主要表達(dá)于細(xì)胞漿中,胞漿內(nèi)有較強(qiáng)的熒光顯示,細(xì)胞核熒光較弱;LPS作用后NF-kB發(fā)生了明顯的核轉(zhuǎn)位,在細(xì)胞核內(nèi)熒光明顯加強(qiáng),細(xì)胞漿內(nèi)熒光減弱。 結(jié)論 1.組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)HPDLCs簡便且成功率較高,第4-8代細(xì)胞具有較高的增殖活性,適用于相關(guān)的體外實(shí)驗(yàn)研究。 2.LPS可直接影響HPDLCs的增殖、抑制其成骨特性,并可刺激HPDLCs引起炎性細(xì)胞因子的分泌,證明LPS是牙周炎癥和牙槽骨吸收的重要毒力因子。 3.LPS可刺激HPDLCs分泌各種炎性細(xì)胞因子,并且具有一定的時效關(guān)系,不同炎性因子其時效關(guān)系不同。 4.LPS刺激可使HPDLCs發(fā)生明顯的NF-kB核轉(zhuǎn)位,證明NF-kB參與了LPS誘導(dǎo)的牙周炎癥反應(yīng)。
【圖文】：

第4代HPoLCs(X400)

放射狀或旋渦狀的成纖維細(xì)胞集落單位，部分細(xì)胞相互接觸(圖1)。隨著培養(yǎng)時間的延長細(xì)胞逐漸相互匯合，密度逐漸增加，一周后可見細(xì)胞基本長滿皿底(圖2)。消化傳代后4h細(xì)胞即可貼壁，24h后貼壁細(xì)胞全部伸展變形。倒置顯微鏡下HPDLCs呈長梭形，具有2一3個胞漿突起;胞體豐滿，胞漿均勻、透明;核圓形或卵圓，位于細(xì)胞中央，，核仁清晰，2一5個核仁(圖3)。傳代
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2702762