【摘要】： 實驗目的 由慢性根尖周炎、牙周炎引起的牙槽骨缺損性疾病在臨床上頗為常見。成骨細胞(Osteoblast)位于骨組織表面，是骨形成以及損傷后修復重建過程中的重要功能細胞，成骨細胞在骨形成和改建過程中可以產(chǎn)生骨基質并分泌多種生物活性物質，如膠原纖維和無定形有機基質，調(diào)節(jié)與影響著自身和破骨細胞的功能。而臨床上在由于感染引起的骨破壞性疾病中，大部分成骨細胞的消失并不是成骨細胞向骨細胞、骨基質和骨膜方向轉化，而是發(fā)生了細胞凋亡。所以現(xiàn)行的牙槽骨缺損性疾病的治療方法難以獲得理想的療效。因而，探討成骨細胞增殖分化及凋亡的特性，從而研究一種促進成骨細胞增殖分化；阻止其凋亡的生物制劑，可以為臨床上骨缺損性疾病的生物學治療開辟新思路。近年來，隨著組織工程學在醫(yī)學各學科的研究不斷發(fā)展，骨替代產(chǎn)品應用于骨缺損性疾病的治療已經(jīng)成為可能，因而研究一種理想的骨誘導劑應用于臨床具有重要意義。 纖維粘連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)是細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)中糖蛋白的最重要成分，主要分布于疏松結締組織，除成纖維細胞外，上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、成骨細胞、軟骨細胞和巨噬細胞也可生成。血漿型FN以單體形式存在，通過N-端的70×10~3Kda的蛋白質與細胞表面特定區(qū)域發(fā)生聚合，單體之間通過二硫鍵橋彼此連接形成FN多聚體，F(xiàn)N的聚合是發(fā)揮其生物學功能的先決條件。FN單體是一種由相似的兩個肽鏈亞單位(A和B鏈)通過羧基端的二硫鍵結構成為分子量約220×10~3Kda的多功能二聚體糖蛋白。由于FN對細胞的生長、增殖分化、粘附移動、損傷修復等過程起到重要的作用，因而受到醫(yī)學各學科研究領域的重視。以往的實驗證明：FN是成骨細胞增殖分化及凋亡的至關重要因子。 本實驗應用外源性FN作用于體外培養(yǎng)的成骨細胞，旨在研究FN對成骨細 胞增殖分化及凋亡的影響，探討應用FN治療骨缺損性疾病的可行性。 實驗方法 1.成骨細胞的分離純化 取生后Zd的Wistar乳鼠拉頸處死后投人盛有75%乙醇的容器中消 毒，剪開頭頂部皮膚，取顱蓋骨放人盛有緩沖液的培養(yǎng)皿中，用緩沖液洗凈， 加人0.25%胰蛋白酶溶液，在37℃恒溫消化巧min。再用lm群血n型膠 原酶溶液在37℃條件下消化90 min，移于離心管中離心(1 O00r/min，5 min)用199培養(yǎng)液將沉淀物洗兩次，吹散細胞沉淀，制成細胞懸液，接種于 培養(yǎng)瓶內(nèi)。差速勃附法純化細胞。 2.成骨細胞的培養(yǎng)及鑒定 調(diào)整上述已純化的細胞懸液細胞密度至1護個/nil，接種于25nil培養(yǎng)瓶 內(nèi)，置于37T、5%COZ培養(yǎng)箱中，2d后換液，除去未貼壁細胞，并適時傳代， 另在一小培養(yǎng)皿中加人蓋玻片，接種少量細胞懸液，置于37℃、5%C02培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)，用I型膠原免疫組化方法作細胞鑒定。 3.成骨細胞的形態(tài)學觀察 應用倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察成骨細胞的生長特性并拍照記錄。將培 養(yǎng)的成骨細胞用胰酶消化，離心，PBS沖洗，0 .3%的戊二醛和四氧化餓雙重 固定，乙醇逐級脫水，醋酸異戊醋置換，臨界點干燥，噴金鍍膜，S一520型掃 描電鏡觀察;培養(yǎng)形成單層細胞，經(jīng)膠原酶消化，分散離心獲得成骨細胞團 塊，加人4%戊二醛預固定，餓酸染色，Hi魷achi一600型透射電鏡下觀察并 拍照紀錄。 4.Alam二cBlueTM法測定細胞增殖率 取培養(yǎng)的成骨細胞第3代，調(diào)整細胞濃度至2 x 104/血，以每孔100閃 接種于96孔板，每組8孔，培養(yǎng)條件為37℃，5%COZ飽和濕度。在含10% 胎牛血清的199液中培養(yǎng)48h，換成濃度為10林歲而，20林歲血，30林歲時， 40林群耐，50林擴而的牛血漿FN，無血清培養(yǎng)72h，在最后4h每孔加入20閃 的AIamarBlu(，TM，37℃、5%CoZ培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育至結束，酶標儀540run、 620nm波長下分別測定各孔吸光度，按說明書要求計算各組均數(shù)并作統(tǒng)計 分析。 5.EUSA方法檢測堿性磷酸酶(ALP)活性 細胞接種至24孔板，24h后換成濃度為ro林歲nil，20林歲nil，30林歲nil， 40林歲耐，50林擴血的牛血漿FN，無血清培養(yǎng)72h。吸出培養(yǎng)液，加0.1% TritonX一100 100林l，置于4℃過夜，然后加人pNPP，37℃孵育30h，3N氫氧 化鈉終止反應。將各孔液體分別移人%孔板，，用酶標儀讀取OD值(波長 405nm)。 6.流式細胞術檢測FN對成骨細胞細胞周期及凋亡的影響 細胞以1 xlos/血接種至25d培養(yǎng)瓶，在含15%胎牛血清的199培養(yǎng) 液中培養(yǎng)3d。換為無血清199培養(yǎng)液。24h后加人濃度為10林歲耐，20林歲 血，30林歲血，40林歲nil，50林歲d的牛血漿FN，無血清培養(yǎng)72h，0.25%胰酶 消化各組細胞。pBS洗2次，加人配制好的pl染液(pl smg、RNase Zmg、生 理鹽水65耐、構緣酸鈉loomg加蒸餾水100而，調(diào)PH值7.2一7.6)，37℃孵 育30min，用FACS流式細胞儀檢測，Ce斷t軟件收集10 000個細胞，Cell Quest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)，根據(jù)G0/G:期、S期、GZ/M期細胞數(shù)。采用 sPss 1 0 .0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。 7.westem blotting法檢測FN作用后成骨細胞Bcl一2及Bax基因的蛋 白表達變化 處理后的細胞，PBS洗2次，離心，加人300閃的裂解buffer。超聲粉碎 后，12000甲而分，4℃，
【圖文】：

圖2分離培養(yǎng)24h后，成骨細胞貼壁生長(倒置相差顯微鏡x100)

成骨細胞在單層鋪滿培養(yǎng)瓶后可出現(xiàn)重疊生長，其中心部細胞密集并可發(fā)生鈣化，形成肉眼可見的散在鈣化結節(jié)(倒置相差顯微鏡x100)
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R780.2

【參考文獻】

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本文編號：2692907