【摘要】：人類微生物群落不僅能與宿主相互作用,而且還可影響宿主健康和疾病狀態(tài)。在某些情況下,微生物群落結(jié)構(gòu)的改變會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生負(fù)面影響。已有研究表明,母體微生物群落與不良妊娠結(jié)局和新生兒疾病之間存在一定的相關(guān)性。母體微生物組被認(rèn)為是新生兒初始微生物組定植的關(guān)鍵因素,新生兒微生物組的最初發(fā)展在很大程度上受母體影響。因此,微生物群落在孕產(chǎn)婦和兒童健康中的作用越來(lái)越受到關(guān)注,深入研究母-嬰微生物組之間的相關(guān)性尤為重要。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,健康足月孕婦胎盤(pán)中檢測(cè)出微生物群,表明胎兒所處環(huán)境并非無(wú)菌。在人類胎盤(pán)微生物的研究中發(fā)現(xiàn),胎盤(pán)微生物組為口腔常見(jiàn)的共生菌種。同樣地,在孕婦羊水也檢測(cè)到口腔微生物的存在。以上研究結(jié)果均提示羊水、胎盤(pán)微生物與口腔微生物之間存在一定的相關(guān)性,表明新生兒初始菌群在出生之前已經(jīng)建立并與母體微生物密切相關(guān)。雖然以往的研究指出胎盤(pán)微生物與口腔微生物間存在一定的相似性,但其研究數(shù)據(jù)是基于胎盤(pán)微生物組與非妊娠受試者口腔微生物進(jìn)行比較得出的,其結(jié)論存在一定的局限性。因此,本研究旨在通過(guò)對(duì)同一妊娠婦女口腔-胎盤(pán)-羊水-新生兒口腔采樣及微生物群落結(jié)構(gòu)的分析,探究母體口腔微生物與新生兒口腔菌群之間的相關(guān)性,對(duì)進(jìn)一步研究新生兒口腔初始菌群來(lái)源以及母-嬰口腔微生物傳輸通路奠定理論基礎(chǔ)。目的1.分析妊娠期母體口腔、羊水、胎盤(pán)以及新生兒口腔的微生物群落結(jié)構(gòu);2.研究母體口腔與新生兒口腔的微生物群落結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性。方法在患者知情同意下,利用Illumina MiSeq平臺(tái),以健康足月妊娠婦女為研究對(duì)象,采集母體口腔、羊水、胎盤(pán)以及新生兒口腔的樣本,基于16S rRNA V3-V4區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序,分析母體口腔、羊水、胎盤(pán)以及新生兒口腔微生物群落的多樣性和菌種組成,探究母-嬰口腔微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性。結(jié)果1.Venn圖結(jié)果示:四組樣本中獨(dú)有OTUs分別是NO(117)、MO(80)、AF(146)和PL(142),分別占總OTUs的6.45%,4.41%,8.04%,7.82%。此外,四組有635個(gè)共有OTUs,約50%的OTUs在所有分組中均可檢測(cè)到。2.分組樣本微生物結(jié)構(gòu)Alpha多樣性分析結(jié)果示:Chao1指數(shù)表明MO組與NO組之間無(wú)明顯差異并且PL組微生物群落中細(xì)菌含量最豐富。Shannon指數(shù)表明,在NO、MO、AF、PL組中微生物群落的細(xì)菌種類無(wú)差異。3.分組樣本微生物結(jié)構(gòu)Beta多樣性分析結(jié)果示:PCoA圖中除了PL組外,NO、MO、AF組中的細(xì)菌Beta多樣性基本相同。分組樣本在四個(gè)象限中沒(méi)有完全分離,并且存在少量樣本的重疊,表明四組樣本的結(jié)構(gòu)有一定的相似性。4.分組樣本門水平菌種分析結(jié)果示:Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Actinobacteria為四組的優(yōu)勢(shì)菌門。其中,MO組與NO組之間有6個(gè)門相對(duì)豐度存在相似性。5.分組樣本屬水平菌種分析結(jié)果示:Sediminibacterium、Streptococcus、Haemophilus、Prevotella、Sphingomonas、Neisseria、Fusobacterium為四組優(yōu)勢(shì)菌屬。其中,MO組與NO組之間有15個(gè)屬相對(duì)豐度存在相似性。6.基于菌群結(jié)構(gòu)的相異度分析結(jié)果示:四組之間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異不顯著,其中NO組和AF組兩組間的群落結(jié)構(gòu)更為相似。結(jié)論該研究表明新生兒口腔菌群的建立與母體微生物組之間存在一定的聯(lián)系,尤其是母體口腔菌群可穿過(guò)胎盤(pán)、到達(dá)羊水并最終部分定植于新生兒口腔,參與新生兒口腔初始菌群的建立。
【圖文】：

2.2.4 數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程以及數(shù)據(jù)分析流程見(jiàn)圖1,詳細(xì)步驟如下：圖2-2-4 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線圖Figure 2-2-4 Experimental technology roadmap（1）數(shù)據(jù)拆分、拼接和過(guò)濾首先，根據(jù)barcode信息對(duì)測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分；其次，根據(jù)雙端序列的overlap關(guān)系將序列拼接為長(zhǎng)的tag；最后，將序列上的barcode和引物序列去除。為了保證測(cè)序結(jié)果的可靠性，需要去除質(zhì)量低的序列。去除的標(biāo)準(zhǔn)：1）去除截短后長(zhǎng)度＜100bp的序列；2）去除截短后N（不確定的模糊堿基）含量＞5%的序列；3）去除嵌合體序列。本過(guò)程采用FLASH[118]（v1.2.8）對(duì)雙端序列進(jìn)行拼接，嵌合體序列采用Vsearch[119]（v2.3.4）軟件過(guò)濾。最后，采用fqtrim(V 0.94)軟件分析得到高質(zhì)量的clean data。（2）OTU聚類分析①根據(jù)引物序列對(duì)V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；②相似性序列（序列相似度＞97%）聚類為OTU（操作分類單元），每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)于一條不同的16S rRNA序列。通過(guò)Vsearch對(duì)序列進(jìn)行聚類

圖 3-2 樣本分組中的 OTU 聚類分析。（a）分組樣本的 Venn 圖。（b）共有 OTUs 相對(duì)豐度差異性。（c）共有 OTUs 的旭日?qǐng)D。Figure 3-2 OTU cluster analysis in the sample grouping. (a) Venn diagram of the grouped samples.(b) Differences in relative abundance of common OTUs. (c) Pin chart of the common OTUs.3.3 樣本微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析3.3.1 分組樣本微生物群落結(jié)構(gòu) Alpha 多樣性Alpha 多樣性為反映菌種豐富度和均勻度的指標(biāo)，，用于評(píng)估微生物群落中菌種豐富度。Chao1 指數(shù)和 Observed species 指數(shù)主要反映樣品中 OTU（菌種）種類的數(shù)目，Shannon 和 Simpson 指數(shù)反映樣品中菌種種類的數(shù)目以及樣品中不同種類的菌種豐度的平均性或均勻性。通過(guò)稀釋曲線，比較相同的測(cè)序深度下分組樣本中 OTU 的數(shù)目，從而去衡量樣本多樣性的高低[160]。當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說(shuō)
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R780.2

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本文編號(hào)：2692390