【摘要】： 前言 臨床上對各種原因引起的伴有牙齒缺失的較大范圍頜骨缺損患者進行快速有效的功能性修復，即在修復頜骨缺損的同時完成種植體的Ⅰ期植入，以縮短患者缺牙時間、減輕患者多次手術的痛苦，盡早完成咬合、咀嚼、吞咽、發(fā)音等功能的修復，是口腔頜面外科、口腔種植科以及口腔修復科醫(yī)生所共同面對的一個難題。近年來組織工程學得到了快速的發(fā)展，其中以種子細胞、支架材料、生長因子為核心內容的骨組織工程技術，通過體外構建細胞——支架復合體，即組織工程化骨，用于替代自體骨、異體骨、異種骨被認為是最具潛力和發(fā)展前途的骨缺損修復材料。為提高頜骨缺損修復同期種植體植入的成功率，除需選擇理想的骨缺損修復材料之外，種植體表面特性也起到了重要作用。為此，本課題嘗試著以骨髓基質細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)為種子細胞、納米羥基磷灰石／膠原(nano-hydroxyapatite／collagen，nHAC)為支架材料、富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)為生長因子來源，于體外構建組織工程化骨用于修復兔下頜骨缺損，并于其中同期植入表面噴砂酸蝕處理的鈦種植體(sandblasted and acid-etched titanium，SLA-Ti)和表面噴砂酸蝕處理后羥基磷灰石涂層的鈦種植體(hydroxyapatite／sandblasted and acid-etched titanium，HA／SLA-Ti)，觀察組織工程化骨修復骨缺損的能力及其負載的兩種不同表面處理的種植體骨愈合能力的差別，具體內容分為以下五部分： 一、富血小板血漿對骨髓基質細胞生物學特性的影響 目的探討自體PRP對體外培養(yǎng)的兔BMSCs生物學特性的影響。方法體外培養(yǎng)的兔BMSCs分為實驗組和對照組，實驗組中加入含1％PRP的DMEM條件培養(yǎng)基，對照組為不含PRP的DMEM培養(yǎng)基，在不同時間點收集兩組細胞，分別進行形態(tài)學觀察、細胞周期分布和增殖指數測定、堿性磷酸酶(ALP)染色和活性測定、骨鈣素(OCN)含量測定以及骨橋蛋白基因(opn)mRNA相對表達量的分析。結果實驗組細胞具有成骨細胞的形態(tài)學特征；PRP作用7d后S期細胞比例較對照組明顯增加，細胞增殖指數由22.89±1.24增至33.15±1.02，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；實驗組ALP染色呈陽性，且ALP活性、OCN含量均較對照組明顯提高，差異具有統(tǒng)計學意義：opn mRNA相對表達量是對照組的3.48倍。結論PRP可促進兔BMSCs的增殖并可提高兔BMSCs的體外成骨潛能，使其向成骨細胞轉化。 二、納米羥基磷灰石／膠原對富血小板血漿促進骨髓基質細胞成骨向分化的影響 目的探討nHAC作為支架材料對PRP體外誘導兔BMSCs向成骨細胞分化能力的影響。方法PRP分別作用于與nHAC聯(lián)合培養(yǎng)的兔BMSCs及常規(guī)培養(yǎng)的兔BMSCs，利用掃描電鏡觀察兔BMSCs在nHAC上的生長情況；通過ALP活性測定、OCN含量測定以及opn mRNA相對表達量的分析，比較兩種培養(yǎng)條件下PRP誘導兔BMSCs向成骨細胞分化能力上的差異。結果聯(lián)合培養(yǎng)的兔BMSCs在nHAC上生長良好，，其ALP活性、OCN含量均較常規(guī)培養(yǎng)明顯增加，且opn mRNA相對表達量是常規(guī)培養(yǎng)組的4.78倍。結論nHAC作為支架材料可明顯提高PRP誘導兔BMSCs向成骨細胞分化的能力。 三、鈦種植體噴砂酸蝕表面羥基磷灰石涂層對骨髓源成骨細胞生物學特性的影響 目的探討HA／SLA-Ti對骨髓源成骨細胞(marrow-origin osteoblasts，MOOBs)生物學特性的影響。方法應用離子束輔助沉積(ion beam assisted deposition，IBAD)技術在噴砂酸蝕(sandblasted and acid-etched，SLA)處理的鈦種植體表面制備羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)涂層，將MOOBs分別接種于HA／SLA-Ti和SLA-Ti表面，觀察其生長情況，并對兩組MOOBs增殖指數、ALP活性、OCN含量以及opn mRNA相對表達量進行比較。結果MOOBs在HA／SLA-Ti表面生長良好，其細胞增殖指數、ALP活性以及OCN含量明顯高于SLA-Ti組；且opn mRNA相對表達量是SLA-Ti組的3.25倍。結論應用IBAD技術在鈦種植體SLA表面制備HA涂層，可明顯促進MOOBs的增殖及其成骨表型的表達，是一種有應用前景的種植體表面處理方法。 四、組織工程化骨修復兔下頜骨缺損的實驗研究 目的探討以兔BMSCs為種子細胞、nHAC為支架材料、PRP為生長因子來源，于體外構建的組織工程化骨修復兔下頜骨缺損的能力。方法兔下頜骨體部范圍為15mm×15mm的全層骨缺損分別采取相應方法修復：A組，組織工程化骨修復；B組，自體髂骨修復；C組，單純nHAC材料修復；D組，空白對照組，缺損不做修復。分別于術后1、3、6個月取材，進行大體標本觀察、放射性核素骨顯像、骨密度測定及組織學觀察。結果大體標本觀察顯示，術后A、B兩組骨缺損區(qū)域逐漸由新生骨組織修復，C組骨缺損區(qū)域僅形成了類軟骨樣組織，D組無骨組織形成，骨缺損區(qū)域由纖維結締組織充填；放射性核素骨顯像結果顯示，術后1個月、三個月時，A、B兩組成骨代謝能力明顯優(yōu)于C組、D組，而A、B兩組之間無顯著差異，術后6個月時，各組之間骨代謝能力無明顯差異；骨密度測定結果顯示A、B、C三組骨缺損區(qū)域骨密度逐漸增加明顯高于D組，術后3個月以后A組、B組骨密度較C組明顯提高，而A、B兩組之間無顯著差異；組織學檢查結果顯示，A組在術后1個月時可見小片狀類骨質出現(xiàn)，nHAC開始降解，術后3個月時新生骨成大片狀結構，術后6個月時nHAC幾乎全部降解，缺損由骨組織修復，其成骨量與B組無明顯差異卻明顯大于C組，D組僅為纖維組織修復。結論組織工程化骨修復頜骨缺損能力與自體髂骨相似而強于單獨使用nHAC，且nHAC材料于體內可完全降解，因此BMSCs與nHAC及PRP復合所構建的組織工程化骨是一種良好的骨缺損替代材料。 五、組織工程化骨修復兔下頜骨缺損同期不同表面處理的鈦種植體植入的實驗研究 目的觀察組織工程化骨修復兔下頜骨缺損同期進行HA／SLA-Ti和SLA-Ti種植體植入后，種植體與周圍新生骨組織發(fā)生骨整合的情況。方法兔BMSCs復合nHAC及PRP用于修復兔下頜骨頰側范圍為15mm×15mm的全層骨缺損，同期分別植入HA／SLA-Ti種植體(A組)和SLA-Ti種植體(B組)。術后1、3、6個月取材，進行大體標本觀察、X線檢查、掃描電鏡觀察、組織學檢查及種植體的推入實驗和拉出實驗。結果大體標本觀察顯示，A組術區(qū)逐漸由新生骨組織修復，種植體周圍形成完善的骨結合界面，界面骨成熟；B組術區(qū)骨愈合狀態(tài)佳，但種植體周圍仍存在少量纖維組織。X線檢查結果顯示，術后1個月A、B兩組骨缺損區(qū)域骨密度較低，種植體周圍大部分為X線透射影；術后3個月A、B兩組骨缺損區(qū)域骨密度增加，與B組相比A組種植體周圍有較多X線阻射影；術后6個月A組種植體周圍為與正常骨組織密度相似的X線阻射影，B組種植體周圍也為與宿主骨密度接近的X線阻射影，但密度并非均勻一致。掃描電鏡結果顯示，A組種植體較B組種植體與周圍新生骨結合的更緊密。組織學檢查的結果顯示，A組新生骨與種植體表面直接結合，骨形成較B組種植體表面骨形成提前，B組種植體與新生骨之間存在纖維組織。推入實驗和拉出實驗結果顯示，術后1個月時A、B兩組種植體的推入應力和拉出負荷無明顯差異，術后3個月后A組種植體的推入應力和拉出負荷明顯較B組提高，差異具有統(tǒng)計學意義。結論修復兔下頜骨缺損的組織工程化骨內同期植入的種植體，可與新生的骨組織形成良好的骨結合，其中HA／SLA-Ti種植體的骨結合能力較SLA-Ti種植體強，且骨愈合時間也較后者提前。
【圖文】：

流式細胞儀檢測兔BMSCs表面抗原特性2、細胞形態(tài)學觀察倒置相差顯微鏡下見，培養(yǎng)7d的對照組細胞與成纖維細胞相似，呈長梭形態(tài)比較一致，呈魚群樣排列;而實驗組細胞表現(xiàn)為成骨細胞樣形態(tài)，呈多角鱗片形，胞體較大，偽足多見，胞漿內分泌物較多，繼續(xù)培養(yǎng)至14d時可見多層生長，并有黑色結節(jié)生成(見圖2)。透射電鏡下見實驗組細胞胞漿內大張的粗面內質網及大量的分泌空泡，線粒體較豐富并可見出胞現(xiàn)象(見圖3)。

倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)14d時ALP染色結果所示，實驗組細胞呈梭形或多角形，胞漿內可見棕黑色陽性著色，而對照組細胞胞漿內未見棕黑色顆粒(見圖4)。實驗組和對照組ALP含量均隨培養(yǎng)時間的延長而增加， 14d時達到高峰，之后ALP有所下降，從7d起實驗組ALP含量較對照組明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義。(見表2)
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R782

【參考文獻】

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本文編號：2690428