【摘要】：目的:間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛存在于人體多種器官組織中,包括骨髓、臍帶、脂肪組織、肌肉組織以及牙源性組織等。牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell from dental pulp,MSC-DP)分離提取于脫落乳牙或成熟恒牙的牙髓組織,是一種獨(dú)特的胚胎神經(jīng)嵴源性的成體干細(xì)胞群。MSC-DP具有比經(jīng)典骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)更強(qiáng)的自我更新能力;體外誘導(dǎo)培養(yǎng)能夠分化為成骨/成牙本質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及更強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞分化潛能,在體內(nèi)能夠形成獨(dú)特的牙髓牙本質(zhì)樣組織;同時(shí)MSC-DP具有優(yōu)越的免疫調(diào)節(jié)性能,能夠有效調(diào)節(jié)CD4+輔助性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞功能,從而治療自身免疫性疾病。MSC-DP因其來(lái)源豐富、獲取容易以及獨(dú)特優(yōu)秀的生物學(xué)性能,成為干細(xì)胞治療中極具應(yīng)用前景的干細(xì)胞源,但其生物學(xué)性能的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。程序性細(xì)胞死亡蛋白l(programmed cell death protein 1,PD-1)是一種免疫抑制性受體,表達(dá)于活化T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞。PD-1受其配體激活后,通過(guò)抑制CD4+輔助性T細(xì)胞的早期活化調(diào)控T細(xì)胞應(yīng)答,從而引起機(jī)體免疫耐受。此外,PD-1在腫瘤免疫中亦發(fā)揮關(guān)鍵作用,通過(guò)誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞凋亡,并抑制其生物學(xué)功能,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。以PD-1信號(hào)為靶點(diǎn)是現(xiàn)代免疫性疾病和抗腫瘤免疫治療中極具應(yīng)用前景的代表性治療方法。然而,學(xué)者通常認(rèn)為“細(xì)胞凋亡相關(guān)受體蛋白”P(pán)D-1并不表達(dá)于間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs),其是否調(diào)控干細(xì)胞功能更未見(jiàn)相關(guān)研究。本課題旨在研究PD-1對(duì)干細(xì)胞生物學(xué)性能,特別是對(duì)人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞性能的調(diào)控作用及其具體分子機(jī)制,為揭示MSC-DP生物學(xué)性能的調(diào)控機(jī)制和PD-1在干細(xì)胞領(lǐng)域的生物學(xué)功能奠定理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究方法:1、體外分離培養(yǎng)人BMMSCs和胚胎神經(jīng)嵴來(lái)源的人MSC-DP,后者包括脫落乳牙干細(xì)胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)、牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells,DPSCs)。2、應(yīng)用 Western blot、qPCR、免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)等檢測(cè)BMMSCs和MSC-DP中PD-1的表達(dá)情況。3、通過(guò)siRNA沉默技術(shù)調(diào)控PD-1的表達(dá)水平、流式細(xì)胞分選技術(shù)篩選PD-1陽(yáng)性/陰性細(xì)胞群,研究PD-1在BMMSCs和MSC-DP干細(xì)胞生物學(xué)性能中的調(diào)控作用。4、通過(guò)siRNA沉默技術(shù)、化學(xué)抑制劑等方式調(diào)控PD-1的表達(dá)水平、CRISPR/Cas9技術(shù)制備PD-1基因敲除的MSC-DP,探索PD-1調(diào)控MSC-DP干細(xì)胞生物學(xué)性能的具體分子機(jī)制。采用SPSS17.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果:1、PD-1在MSC-DP的細(xì)胞膜上呈持續(xù)性表達(dá),而B(niǎo)MMSCs不表達(dá)PD-1;PD-1與多種干細(xì)胞表面標(biāo)記物共表達(dá)于MSC-DP和人牙髓組織,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示PD-1+/CD73+雙陽(yáng)性細(xì)胞比率為16.76%、PD-1+/CD90+雙陽(yáng)性細(xì)胞比率為17.55%、PD-1+/CD105+雙陽(yáng)性細(xì)胞比率為11.86%;且PD-1表達(dá)水平隨MSC-DP傳代擴(kuò)增而降低。2、siPD-1沉默MSC-DP的PD-1表達(dá),MSC-DP的增殖率、細(xì)胞群倍增次數(shù)以及S/G2/M期比例明顯下降(P0.05),而MSC-DP成骨/成牙本質(zhì)向和成神經(jīng)向分化能力明顯提高(P0.001);與PD-1-MSC-DP相比,PD-1+MSC-DP具有顯著升高的細(xì)胞增殖率、細(xì)胞群體倍增次數(shù)以及S/G2/M期比例(P0.001),同時(shí)具有顯著降低的成骨/成牙本質(zhì)向和成神經(jīng)向分化能力(P0.001)。siPD-1轉(zhuǎn)染處理對(duì)BMMSCs生物學(xué)性能無(wú)明顯調(diào)控作用。3、MSC-DP通過(guò)PD-1及下游SHP2/ERK/Notch信號(hào)通路調(diào)控其增殖率、細(xì)胞群體倍增次數(shù),從而促進(jìn)其自我更新;通過(guò)PD-1及下游SHP2/ERK/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控其鈣結(jié)節(jié)形成能力和成骨蛋白表達(dá)水平,從而抑制成骨/成牙本質(zhì)向分化。結(jié)論:1、胚胎神經(jīng)嵴來(lái)源的MSC-DP穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞膜蛋白PD-1,PD-1可作為一種新的牙源性干細(xì)胞表面標(biāo)記物。2、PD-1能夠促進(jìn)MSC-DP自我更新能力,抑制其多向分化潛能,是維持MSC-DP生物學(xué)性能的關(guān)鍵因素。3、PD-1通過(guò)SHP2/ERK/Notch信號(hào)通路調(diào)控MSC-DP增殖;通過(guò)SHP2/ERK/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控MSC-DP成骨/成牙本質(zhì)向分化。
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為探宄ＰＤ－１及其配體ＰＤ－Ｌ１是否在ＢＭＭＳＣｓ和ＭＳＣ－ＤＰ表達(dá)，，我們體外分逡逑離培養(yǎng)了人ＢＭＭＳＣｓ和人ＭＳＣ－ＤＰ，后者包括ＳＨＥＤ和ＤＰＳＣｓ，檢測(cè)ＢＭＭＳＣｓ、逡逑ＳＨＥＤ和ＤＰＳＣｓ的ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１表達(dá)水平。ｑＰＣＲ結(jié)果顯示ＳＨＥＤ和ＤＰＳＣｓ表達(dá)逡逑尸／）－７，而ＢＭＭＳＣｓ不表達(dá)且＿與ＤＰＳＣｓ相比，ＳＨＥＤ具有較高ＰＺ）－７塞想表逡逑達(dá)水平邋ＣＰ＜０．０１）（圖邋３．１邋Ａ）。ＢＭＭＳＣｓ、ＳＨＥＤ邋和邋ＤＰＳＣｓ邋均表達(dá)尸黑％邋ＳＨＥＤ逡逑和ＤＰＳＣｓ相比，ＢＭＭＳＣｓ具有較高．ｆ／ＷＪ表這水ｆ邋（Ｔ＜邋０．０１）（圖３．１邋Ａ）。進(jìn)』逡逑步邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋檢測(cè)邋ＢＭＭＳＣｓ、ＳＨＥＤ邋和邋ＤＰＳＣｓ邋的邋ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１邋蛋白表達(dá)水平，逡逑結(jié)果與ｑＰＣＲ檢測(cè)結(jié)果一致ＢＰ邋ＳＨＥＤ和ＤＰＳＣｓ表達(dá)ＰＤ－１，而ＢＭＭＳＣｓ不表達(dá)逡逑ＰＤ－１；簋與ＤＰＳＣｓ相比，ＳＨＥＤ具有較高．ＰＤ－１蛋白表達(dá)水乎（圖３．１邋Ｂ邋）邋ｃＢＭＭＳＣｓ、逡逑ＳＨＥＤ和ＤＰＳＣｓ均表達(dá)ＰＤ－Ｌ１１且與ＳＨＥＤ和ＤＰＳＣｓ相比，ＢＭＭＳＣｓ具有較高ＰＤ－Ｌ１逡逑蛋白表達(dá)水平（圖３．１邋Ｂ）。此外，ＰＤ－１蛋白表達(dá)水平隨著ＳＨＥＤ細(xì)胞傳代而明Ｍ降逡逑低（圈３．１邋Ｃ）。上述研究結(jié)果表明，ＰＤ－１僅表達(dá)于ＭＳＣ－ＤＰ，而不表達(dá)于ＢＭＭＳＣｓ；逡逑ＰＤ－Ｌ１在ＢＭＭＳＣｓ和ＭＳＣ－ＤＰ均有表達(dá)。逡逑

邐＾ｍｍｒｎｒｎ＾ｍｍ邋３３ＫＤ逡逑■邐Ｐ－ａｃｔｉｎ邐４３ＫＤ逡逑圖３．２邋ＰＤ－１在ＭＳＣ－ＤＰ的表達(dá)定位逡逑（Ａ）兔愈kr灄Ｓ＾ＰＤ－１邐和邋ＰＤ－Ｌ１邋：粗邋ＢＭＭＳＣｓ、．邋ＳＨＥＤ邋和邋ＤＰＳＣｓ邋＿＿＾ｆｆｃ逡逑（Ｂ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋檢鍘Ｓ＃邋ＳＨＥＤ邋和邋ＤＰＳＣｓ邋胞佭蛋白慕達(dá)邋ＰＤ－１，ＢＭＭＳＣｓ邋事贏達(dá)邋ＰＤ－１；邋ＳＨＥＤ、逡逑ＤＰＳＣｓ邋和邋ＢＭＭＳＣｓ邋胞桯＿邋白邋＿４邋ＰＤ－Ｌ１？邋：j⒊擼唬玻板澹蹂澹礤義

本文編號(hào)：2690329