【摘要】：[目的]利用云南省特有的動(dòng)物資源,以滇藍(lán)尾蠑螈(Cynops cynaurus)作為研究對(duì)象,探索蠑螈前梯度蛋白(newt Anterior gradient, nAG)在滇藍(lán)尾蠑螈下頜骨及前肢再生過(guò)程中的表達(dá)特點(diǎn)。 [方法]取成年野生型滇藍(lán)尾蠑螈共60條,雌雄各半,隨機(jī)分為兩組,每組30只,在三卡因麻醉下分別截除下頜骨正中1/3及左前肢肘關(guān)節(jié)以下部分,術(shù)后定時(shí)大體觀察蠑螈生存及組織再生情況,5天、12天時(shí)各處死每組15只蠑螈,按組別切取下頜骨、左前肢再生組織以及相對(duì)應(yīng)動(dòng)物右前肢、下頜骨的正常組織為對(duì)照,通過(guò)RT-PCR技術(shù)獲取nAG蛋白編碼基因,直接測(cè)序,與GeneBank中公認(rèn)序列進(jìn)行比對(duì),檢測(cè)再生組織中是否存在nAG蛋白；同時(shí)應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)下頜骨及肢體再生過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)nAG蛋白的表達(dá)及分布情況。使用HPIAS-1000軟件分析原位雜交石蠟切片中nAG蛋白的表達(dá)濃度并計(jì)算nAG蛋白陽(yáng)性表達(dá)率。利用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 [結(jié)果]所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后均健康成活,被切除的下頜骨和肢體在取材時(shí)間點(diǎn)已實(shí)現(xiàn)部分再生。具體過(guò)程如下：截除術(shù)后1小時(shí),創(chuàng)口止血完成,口底組織收縮,使下頜骨兩斷端相對(duì)靠攏,前肢殘端創(chuàng)口則軸向聚攏；術(shù)后3天,創(chuàng)口表面光滑,已有創(chuàng)面上皮(wound epidermis, WE)覆蓋；術(shù)后5天,上皮頂帽(apical ectodermal ridge, AEC)形成；術(shù)后7天,上皮頂帽增厚；術(shù)后12天,截?cái)嗝娉霈F(xiàn)透明小突起,形成明確胚芽(blastma, BL)。通過(guò)對(duì)滇藍(lán)尾蠑螈再生組織提取總RNA,利用RT-PCR技術(shù)獲取的nAG蛋白基因片段大小及序列證實(shí)與目的基因序列一致。原位雜交結(jié)果顯示,在整個(gè)下頜骨及肢體再生過(guò)程中,表皮的基底細(xì)胞及神經(jīng)纖維都有nAG蛋白的陽(yáng)性表達(dá),并且在再生過(guò)程中不同部位、不同時(shí)間點(diǎn),陽(yáng)性表達(dá)的區(qū)域各不相同。nAG蛋白在術(shù)后5天頂帽下方軟骨(骨)組織和間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá),神經(jīng)組織也有表達(dá),術(shù)后12天在表皮的基底細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。nAG蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在不同時(shí)間不同組織、相同時(shí)間不同組織及相同組織不同時(shí)間表達(dá)有差異性(P0.05)。 [結(jié)論]1.成體滇藍(lán)尾蠑螈具有再生下頜骨和肢體的能力,其再生方式為割處再生；2.成體滇藍(lán)尾蠑螈可作為下頜骨再生研究的理想動(dòng)物模型；3.成體滇藍(lán)尾蠑螈下頜骨及肢體再生過(guò)程中都有nAG蛋白的陽(yáng)性表達(dá),經(jīng)RT-PCR實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的nAG蛋白基因片段與目的蛋白基因序列一致,證實(shí)再生組織內(nèi)有nAG蛋白的表達(dá)；4.nAG蛋白與蠑螈下頜骨及肢體再生密切相關(guān),成體滇藍(lán)尾蠑螈下頜骨及肢體再生過(guò)程中都有nAG蛋白的陽(yáng)性表達(dá)；5.nAG蛋白與蠑螈下頜骨及肢體再生密切相關(guān),且其表達(dá)部位與再生時(shí)間有關(guān)。在蠑螈肢體和下頜骨再生過(guò)程中,nAG蛋白在蠑螈的再生組織中隨著時(shí)間的改變,在不同的組織中陽(yáng)性表達(dá)的強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變。術(shù)后5天,nAG蛋白主要表達(dá)在神經(jīng)纖維及間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)；術(shù)后12天,nAG蛋白主要表達(dá)在AEC和其下方的去分化細(xì)胞內(nèi)；6.nAG蛋白只出現(xiàn)在下頜骨及前肢再生時(shí)期處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞中,其陽(yáng)性表達(dá)在細(xì)胞的增殖與分化中發(fā)揮著重要作用,一旦細(xì)胞分化成熟后即表達(dá)陰性。提示nAG蛋白可以作為反映再生下頜骨及肢體再生中細(xì)胞增殖分化的重要指征；7.nAG蛋白是一種細(xì)胞增生和分化因子,是否為啟動(dòng)因子及是否也存在于高等級(jí)哺乳動(dòng)物還需要進(jìn)一步研究。
【圖文】：

滇藍(lán)尾嶸蛻

所有滇藍(lán)尾嶸螺下領(lǐng)骨部分截除及左前肢截?cái)嘈g(shù)后均存活。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均能再生下領(lǐng)骨及左前肢，局部無(wú)感染壞死等并發(fā)癥。1.術(shù)前照片(圖1一l):正常下領(lǐng)骨及前肢，依紅線部位截除組織。圖1一1術(shù)前正常下頗骨及肢體2.術(shù)后當(dāng)天(圖1一2):截除術(shù)后1小時(shí)，創(chuàng)口止血完成，在周圍肌肉的牽拉下，下領(lǐng)骨斷端相對(duì)靠攏，損傷的細(xì)胞碎屑和凝結(jié)的血塊構(gòu)成傷口的臨時(shí)覆蓋;肢體創(chuàng)口周圍組織缺乏骨組織的支持，殘端在局部軟組織的作用下向創(chuàng)口聚攏，，周圍皮膚邊緣出現(xiàn)了輕微的皺縮。圖l一2術(shù)后當(dāng)天殘余下領(lǐng)骨在口底組織作用下向創(chuàng)口輕微靠攏，前肢殘端創(chuàng)口軸向聚攏紅色箭頭所示為缺損部位3.術(shù)后3天(圖1一3):截?cái)嗝婀饣瑹o(wú)滲血、感染，可觀察到創(chuàng)口皮膚收縮，斷面被一薄層上皮組織覆蓋，呈半透明狀，創(chuàng)口上皮 (woundePidermis
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R782.2

【相似文獻(xiàn)】

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1 王琰;滇藍(lán)尾蠑螈前肢及下頜骨再生組織nAG蛋白基因表達(dá)分析[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2011年

本文編號(hào)：2688554