【摘要】： 生物礦化是生物體內(nèi)礦物形成過程的統(tǒng)稱,是一個受到眾多因素精密調(diào)控的生理過程。其研究涉及生物學(xué)、化學(xué)、結(jié)晶學(xué)、材料學(xué)、礦物學(xué)和醫(yī)學(xué)等學(xué)科,是一門多學(xué)科共同推進的交叉前沿學(xué)科。生物體內(nèi)礦化過程調(diào)控機制的研究在很大程度上依賴于體外礦化模型的構(gòu)建和應(yīng)用。目前應(yīng)用較多的單分子膜模型和凝膠礦化模型由于自身的缺陷難以對生物體內(nèi)硬組織礦化過程進行有效模擬。本研究擬利用具有離子選擇透過性的陽離子膜和透析膜構(gòu)建雙膜體外礦化系統(tǒng),并應(yīng)用此模型對牙體硬組織生物礦化相關(guān)的無機因素、有機因素及無機/有機因素的協(xié)同作用進行研究,以期構(gòu)建一個有效的生物礦化模型,對牙體組織中生物磷灰石晶體的礦化調(diào)控機制進行探討。所取得的研究結(jié)果如下: 1體外礦化雙膜系統(tǒng)的構(gòu)建及檢測 利用陽離子膜和透析膜構(gòu)建雙膜系統(tǒng),對系統(tǒng)的穩(wěn)定性、可靠性進行了檢測。結(jié)果表明,雙膜系統(tǒng)在溶液環(huán)境中反應(yīng)3日即可獲得有效的礦化物晶體沉積,隨著反應(yīng)時間的延長,系統(tǒng)的失敗率增加,但晶體成份及形態(tài)無顯著變化。在系統(tǒng)內(nèi)加入1ppm氟離子后,在陽離子膜表面形成了大量桿狀氟磷灰石晶體;而加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基后,陽離子膜表面則形成了大量片層狀晶體,晶體成份為磷酸八鈣。通過對雙膜系統(tǒng)礦化模型的改建,初步構(gòu)建了穩(wěn)定的礦化反應(yīng)系統(tǒng),并通過氟離子和含10%胎牛血清的培養(yǎng)基初步證實了雙膜體外礦化模型的可靠性及有效性,為進一步的研究打下了基礎(chǔ)。 2無機因素在體外對磷灰石晶體礦化作用的研究 利用先前實驗構(gòu)建的雙膜體外礦化模型對氟離子、鎂離子及碳酸氫根離子在體外對磷灰石晶體礦化的作用進行研究。實驗結(jié)果顯示,不同濃度氟離子的加入對晶體的成份及形態(tài)均產(chǎn)生了影響。低濃度的氟即可對晶體形態(tài)產(chǎn)生顯著作用,晶體由不規(guī)則的蠕蟲狀轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸欢ㄅ帕蟹较虻臈U狀晶體,成份也由磷酸八鈣轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和氟磷灰石的混合物。氟離子濃度達到或超過5ppm后,大量桿狀的氟磷灰石晶體優(yōu)先在磷酸鹽溶液中形成,而陽離子膜表面無明顯晶體沉積。加入鎂離子后,陽離子膜表面晶體沉積受到抑制,晶體結(jié)晶度降低,但晶體成份仍為磷酸八鈣;碳酸氫根離子的加入則促進了磷酸八鈣晶體的礦化,并且直接參與了晶體的構(gòu)成。 以上結(jié)果表明,低濃度的氟離子即可在磷酸八鈣向羥基磷灰石的轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮作用,并導(dǎo)致晶體形態(tài)的變化。鎂離子則可能通過和鈣離子的競爭作用抑制磷酸八鈣晶體的生長,碳酸氫根離子促進磷酸八鈣晶體的礦化,取代磷酸氫根離子,參與晶體的構(gòu)成。其對局部礦化微環(huán)境pH值的影響作用也是其促進磷酸八鈣晶體礦化的可能因素之一。無機因素在磷灰石晶體的成核、生長過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。 3有機因素在體外對磷灰石晶體礦化作用的研究 利用雙膜系統(tǒng)對單一組份有機大分子物質(zhì)(牛血清白蛋白,提取的豬釉原蛋白片段及重組小鼠細胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白),多組份有機混合物(大鼠牙髓細胞礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)上清)在體外對磷灰石晶體礦化的影響進行研究。實驗結(jié)果顯示,在有機物的參與下,陽離子膜表面沉積的晶體主要成份均為磷酸八鈣。在礦化相關(guān)蛋白組(釉原蛋白和細胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白)中,形成了呈球狀聚集的晶體團,而牛血清白蛋白組中則未發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。有機大分子的加入對晶體生長均產(chǎn)生了抑制作用。大鼠牙髓細胞礦化誘導(dǎo)后培養(yǎng)上清對磷酸八鈣晶體形態(tài)作用明顯,相對于對照組,形成了形態(tài)和排列更規(guī)則的片層狀晶體。 上述結(jié)果說明,相對于晶體的成份,有機大分子對晶體形態(tài)的影響作用更強。礦化相關(guān)蛋白可能直接參與生物磷灰石晶體的成核,并通過與晶體特定晶面的相互作用調(diào)控生物晶體的取向性生長。 4無機/有機因素共同作用對磷灰石晶體體外礦化的影響 利用雙膜系統(tǒng)對無機/有機因素共同作用對磷灰石晶體體外礦化作用的影響進行研究。分別檢測了牛血清白蛋白和氟離子,及釉原蛋白和氟離子的共同作用對晶體礦化的影響。實驗結(jié)果顯示,無機/有機因素的協(xié)同作用對磷灰石晶體的形態(tài)及成份均產(chǎn)生了作用,當(dāng)牛血清白蛋白與氟離子共同作用時,磷酸八鈣晶體向另一種羥基磷灰石的前體物質(zhì)磷酸氫鈣轉(zhuǎn)化,而當(dāng)釉原蛋白和氟離子共同作用時,晶體則向磷灰石轉(zhuǎn)化。這說明礦化相關(guān)的釉原蛋白可能通過參與成核及與特定晶面的相互作用,對特定晶體的生長有特異性的作用。 綜上所述,無機離子和有機大分子在磷灰石晶體的生物礦化過程中發(fā)揮著不同的調(diào)控作用。無機離子通過取代羥基磷灰石前體物質(zhì)中的羥基(氟離子)、與鈣離子競爭磷灰石晶體表面生長點(鎂離子)等作用,改變晶體的熱力學(xué)穩(wěn)定性,從而影響礦化物的成份。而有機大分子則通過參與成核及其功能基團與生長中晶體特定晶面的結(jié)合,調(diào)控晶體的形態(tài)。此外,釉原蛋白和細胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白有可能直接參與了晶體的成核。有機/無機因素的協(xié)同作用則是生物礦化物成份和形態(tài)的決定因素。
【圖文】：

-33-圖 1.1 雙膜系統(tǒng)構(gòu)建示意圖束后，去離子水輕柔沖洗陽離子膜及表面礦物，70°描電鏡（SEM）對膜表面的礦化物進行形態(tài)觀察；晶上隨機挑選 30 個測量點進行測量；將晶體從陽離子洗，充分干燥后 X 線衍射法（XRD）及能譜分析（統(tǒng)在 3 天后均保持完好（12/12）, 7 天后 83%（10/1側(cè)封口膜脫落，導(dǎo)致透析膜脫落。10 天后 50%（6/

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文敗模型均系離心管外固定透析膜的封口膜脫落，導(dǎo)致反應(yīng)空間開放，模型失敗。模型最長維持時間為 14 日。反應(yīng) 3 天、7 天、10 天后，陽離子膜表面均有少量晶體沉積，但晶體量并沒有顯著增加。透析膜表面則無明顯晶體沉積。SEM 結(jié)果顯示，陽離子膜表面沉積有大量形態(tài)相似，尺寸均一排列無明顯取向性的蠕蟲狀礦化物，隨反應(yīng)時間的延長，，陽離子膜表面無定形礦化物量增加（圖 1.1）。蠕蟲狀晶體長度為 0.82±0.24μm。XRD 檢測顯示，3、7、10 天后，沉積物主要成份均為磷酸八鈣（OCP）（圖 1.2），能譜分析結(jié)果顯示，礦化沉積物平均 Ca/P 為 1.313（n=6），接近 OCP 的 1.33。FTIR 結(jié)果中，1113，1029，964，601，563cm-1處出現(xiàn)了 PO43-的非對稱伸縮振動峰，916cm-1處的振動峰表明 HPO42-基團的存在，說明沉積物成份為 OCP（圖 1.3）。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R78

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