【摘要】：背景和目的： 牙周病治療的最終目標(biāo)是重建因炎癥過(guò)程而破壞的牙周組織,恢復(fù)其結(jié)構(gòu)和功能,即實(shí)現(xiàn)牙周組織的再生。但因牙周病喪失的牙周組織,其修復(fù)與重建的難度很大。多年來(lái),人們一直在尋求能有效增加牙周新附著、促進(jìn)牙周組織再生的治療方法,并已開(kāi)展了牙周骨移植、引導(dǎo)牙周組織再生(GTR)技術(shù)等多方面的研究,取得了一定的進(jìn)展,但在恢復(fù)牙周組織的生理結(jié)構(gòu)和功能上還遠(yuǎn)未達(dá)到所期望的目標(biāo)。組織工程應(yīng)用于牙周組織缺損修復(fù)為牙周病的治療開(kāi)辟了一條新途徑。 組織工程學(xué)的主要研究重點(diǎn)在于以下三個(gè)方面：(1)種子細(xì)胞的來(lái)源；(2)生物載體支架材料的選擇；(3)有效的細(xì)胞因子。要進(jìn)行系統(tǒng)的牙周組織工程研究,就必須首先對(duì)以上三個(gè)問(wèn)題進(jìn)行探討、研究和解決。其中,選擇合適的種子細(xì)胞和有效的細(xì)胞因子是非常重要的。 誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞(induced Pluripotent Stem cells, iPS細(xì)胞)來(lái)源于成體細(xì)胞,其獲得方法相對(duì)簡(jiǎn)單穩(wěn)定.不需要使用生殖細(xì)胞或破壞早期胚胎.在技術(shù)上和倫理上都更有優(yōu)勢(shì)。iPS細(xì)胞具有與胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells,ESC)相似的生物學(xué)特性并能在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下分化為3個(gè)胚層的細(xì)胞,是具有全能分化能力的干細(xì)胞。此外,iPS細(xì)胞可由患者自身細(xì)胞誘導(dǎo)獲得,具有與患者自身相同的基因組成,不會(huì)引起機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)。這種種特性表明iPS細(xì)胞成為理想種子細(xì)胞的可能性。 以前很多研究顯示了釉基質(zhì)蛋白(enamel matrix derivates, EMD)在牙周再生中的作用。EMD能夠誘導(dǎo)無(wú)細(xì)胞外源性纖維牙骨質(zhì)的再生(acellular extrinsic fiber cementum, AEFC)°。無(wú)細(xì)胞性牙骨質(zhì)與牙本質(zhì)的結(jié)合較細(xì)胞性牙骨質(zhì)與牙本質(zhì)的結(jié)合更加牢固。Boyan等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)EMD可能具有骨促進(jìn)而不是骨誘導(dǎo)作用,但使用劑量應(yīng)達(dá)到或超過(guò)一定的閾值。在牙周組織再生的過(guò)程中,EMD可能作為一種基質(zhì),形成與牙周組織發(fā)育時(shí)類似的微環(huán)境,通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞的功能活動(dòng)而有利于牙槽骨的再生。 本研究中,體外實(shí)驗(yàn)研究iPS細(xì)胞的成骨分化和EMD對(duì)iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)作用；體內(nèi)實(shí)驗(yàn),將iPS細(xì)胞和EMD共同用于牙周組織骨缺損的組織工程學(xué)修復(fù),探討將其應(yīng)用于牙周再生的可行性。 方法和材料： (1)使用基質(zhì)膠(Matrigel)包被培養(yǎng)皿,采用無(wú)滋養(yǎng)層的方法培養(yǎng)人的iPS細(xì)胞。RT-PCR檢測(cè)培養(yǎng)人iPS細(xì)胞中干細(xì)胞特異性基因Oct4和Nanog的表達(dá)。然后采用克隆懸浮的方法獲取擬胚體(embryoid body, EB)。 (2)收集懸浮培養(yǎng)形成的EB,移入0.1%明膠處理過(guò)的培養(yǎng)板中,貼壁,并分別在普通培養(yǎng)液、加了礦化誘導(dǎo)液的培養(yǎng)液和加了EMD的培養(yǎng)液中培養(yǎng),觀察不同的培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞的向成骨方向分化和體外礦化的影響。采用PCR和Real-time PCR檢測(cè)成骨相關(guān)因子和蛋白,包括Runx2, OC, BSP等的mRNA表達(dá)；分別檢測(cè)不同培養(yǎng)液中的細(xì)胞在培養(yǎng)后的第7,12,23,30天的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的活性,觀察不同培養(yǎng)液中細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的ALP蛋白活性；將細(xì)胞在不同培養(yǎng)液中培養(yǎng)28天后,茜素紅染色觀察其在體外形成礦化結(jié)節(jié)的能力,并分析其礦化面積所占的百分比。 (3)取12.5天左右的孕鼠,原代培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast, MEF),使用適量γ射線照射后用于制備滋養(yǎng)層。在MEF滋養(yǎng)層上培養(yǎng)小鼠的iPS細(xì)胞,使用懸滴法獲得EB. (4)在裸小鼠的下頜磨牙區(qū)制作牙周骨缺損,然后使用組織工程技術(shù)修復(fù)牙周缺損。實(shí)驗(yàn)分為三組：?jiǎn)渭儾牧辖M,材料+EMD組和材料+EMD+鼠iPS細(xì)胞組,術(shù)中所用的材料為羥基磷灰石／/絲復(fù)合支架材料。術(shù)后12和24天,Real-time PCR檢測(cè)三組標(biāo)本其新生骨組織的成骨相關(guān)因子和蛋白R(shí)unx2, OC, BSP,Osx的mRNA表達(dá)；對(duì)標(biāo)本進(jìn)行Micro-ct檢測(cè),立體觀察分析牙周缺損區(qū)硬組織的新生情況；組織學(xué)分析來(lái)觀察缺損處成骨,成牙骨質(zhì)以及牙周修復(fù)的狀況。 結(jié)果： (1)在顯微鏡下觀察,未分化的人iPS細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng),不典型的圓形或橢圓形,集落邊緣光滑清晰,有的集落邊緣可見(jiàn)有少量細(xì)胞分化。細(xì)胞呈團(tuán)狀排列,胞核大,胞漿少,核漿比較高�？寺∵吘壏只蟮募�(xì)胞呈梭形或多邊型,細(xì)胞核小,胞漿豐富。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示培養(yǎng)的人iPS細(xì)胞中有Oct4和Nanog的表達(dá)。鏡下可觀察到,形成的EB懸浮在培養(yǎng)液中,呈現(xiàn)為規(guī)則或不太規(guī)則的球形。中心較致密,邊緣透亮。 (2) RT-PCR結(jié)果顯示,細(xì)胞BSP的mRNA表達(dá)水平,EMD和普通培養(yǎng)液中相差不大,均低于礦化誘導(dǎo)液組,統(tǒng)計(jì)學(xué)上有極顯著性差異(P0.01)。第20天時(shí),Runx2的mRNA表達(dá)水平,EMD組高于礦化誘導(dǎo)液組和普通培養(yǎng)液組,礦化誘導(dǎo)液組又高于普通培養(yǎng)液組,且有極顯著性差異(P0.01)。在培養(yǎng)的第30天,同樣的,EMD組仍然有最高水平的表達(dá),且差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在第20和30天時(shí),OC的mRNA表達(dá)水平,EMD組均為最低,且與其他兩組相比,均有極顯著性差異(P0.01); ColI的mRNA表達(dá)水平,在礦化誘導(dǎo)液組中最高,且其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而其余兩組差別不大。茜素紅染礦化結(jié)節(jié)的結(jié)果也發(fā)現(xiàn),三組中,EMD實(shí)驗(yàn)組生成的礦化結(jié)節(jié)也最少(P0.01)。ALP活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在第23天左右,不同培養(yǎng)液中的細(xì)胞其ALP活性達(dá)到最大值,且EMD培養(yǎng)液中的細(xì)胞ALP活性低于另外兩組。 (3)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在術(shù)后12天和24天,相較其它兩組而言,材料+EMD+鼠iPS細(xì)胞的動(dòng)物組均有較高的OC, Osx和Runx2的mRNA基因表達(dá)(P0.01或者0.05)。組織學(xué)分析顯示,術(shù)后12天和24天,新生成骨的百分比,在材料+EMD對(duì)照組中與在單純材料組中的相似。在絲材料+EMD+iPS細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組中比在其他兩個(gè)組中都要高,且有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.01)。Micro-CT結(jié)果分析顯示在相同層次上,EMD+iPS細(xì)胞移植組的標(biāo)本比EMD組的新形成的硬組織中多。使用3-D軟件將組織缺損處從CT立體圖像中切出來(lái),也可以明顯看出實(shí)驗(yàn)組的硬組織密度要比對(duì)照組高的多,這些都提示了iPS細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組中更多硬組織的生成。HE染色也顯示,術(shù)后24天,移植了iPS細(xì)胞的動(dòng)物組有更多的新生骨組織和新生牙骨質(zhì)。 結(jié)論： 體外細(xì)胞誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中,EMD能很強(qiáng)的促進(jìn)RUNX2的mRNA表達(dá),但是卻抑制了OC的表達(dá)和體外礦化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EMD可能促進(jìn)間充質(zhì)前體干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化,但卻抑制了其終末分化為成熟的成骨細(xì)胞和體外礦化。 體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,移植了iPS細(xì)胞和EMD可促進(jìn)動(dòng)物新生牙骨質(zhì)和牙槽骨的生成,有利于牙周缺損的修復(fù),提示iPS細(xì)胞作為牙周組織工程種子細(xì)胞的可能性。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R781.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉宏偉,歐龍,龐勁凡,袁志萍;自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞用于牙周骨缺損移植的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2000年03期

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本文編號(hào)：2680254