【摘要】：背景和目的 近年來一些病例報(bào)告顯示：患有根尖周炎或根尖膿腫的年輕恒牙,經(jīng)治療后牙根尖持續(xù)發(fā)育成形。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為：根尖周炎伴發(fā)瘺管及根尖透射影像,牙髓活力測(cè)試陰性時(shí)牙髓已全部壞死,牙根將停止發(fā)育,顯然,傳統(tǒng)知識(shí)難于解釋此現(xiàn)象。學(xué)者推測(cè)根管內(nèi)及附近組織中一定還存在能促使牙根繼續(xù)發(fā)育成形的因素。由此提出“血管重建”假說,并認(rèn)為：年輕恒牙寬大的根尖提供了從根管腔到根尖周組織的良好通路,當(dāng)僅有部分牙髓感染時(shí),可能引發(fā)根尖周疾病；然而由于通暢的血液循環(huán),牙髓和根尖乳頭中的干細(xì)胞也許仍存活于有感染的組織中,并可發(fā)生牙髓再生及根尖成形。2006年,Sonoyama[8]從阻生智齒的根尖乳頭中分離得到具有高度增殖能力和多向分化潛能的干細(xì)胞,將其命名為根尖乳頭干細(xì)胞(stem cells from apical papilla,SCAP)。研究表明,與牙髓干細(xì)胞相比(dental pulp stem cells, DPSCs), SCAP表現(xiàn)出更高的溴脫氧尿苷吸收率、數(shù)量倍增能力,更強(qiáng)的細(xì)胞遷移能力以及更多的細(xì)胞陽性表達(dá)STRO-1(間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志)。SCAP經(jīng)成骨、成脂和神經(jīng)方向誘導(dǎo)后,具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分化的能力。體外擴(kuò)增的SCAP以羥基磷灰石/磷酸三鈣(hydroxyapatite/tricalcium phosphate,HA/TCP)為載體,在免疫缺陷小鼠體內(nèi)能形成牙髓牙本質(zhì)樣復(fù)合體。Huang以聚乙丙交酯(poly-D,L-lactide and glycolide, PLG)為載體,將SCAP接種于載體上,利用根管片段模型進(jìn)行牙髓再生的實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示不僅有含血管的牙髓樣組織生成,更重要的是,原有牙本質(zhì)和MTA表面有一層連續(xù)均勻的牙本質(zhì)樣組織生成。表明人SCAP分化為成牙本質(zhì)樣細(xì)胞后,進(jìn)而形成牙本質(zhì)。患有根尖周炎或根尖膿腫的年輕恒牙中存活的SCAP可能具有促使病變根尖周組織繼續(xù)發(fā)育成形的作用。 哺乳動(dòng)物的牙根發(fā)育是一個(gè)長(zhǎng)期的過程,包括牙根發(fā)育啟動(dòng)、牙根延長(zhǎng)并建立牙周附著關(guān)系、牙齒萌出直至咬合關(guān)系建立、最后牙根發(fā)育完成、根尖孔閉合。在這一過程中,牙根進(jìn)一步發(fā)育同時(shí)伴有牙周組織形成及牙周附著的建立,從而使牙根及牙周組織形成一個(gè)功能單位被錨定在頜骨上。牙根及牙周組織共同的發(fā)育依賴于發(fā)育期牙根的根端組織持續(xù)增殖并分化。在結(jié)構(gòu)上,發(fā)育期牙根的根端組織包含雙層上皮細(xì)胞構(gòu)成的鞘樣結(jié)構(gòu),即Hertwig上皮根鞘(Hertwig's epithelial root sheath,HERS),上皮根鞘將其下方的外胚間充質(zhì)組織劃分為牙乳頭及牙囊。以往的研究表明牙囊可分化形成牙周膜、牙骨質(zhì)和牙槽骨等牙周組織,而牙乳頭形成牙本質(zhì)及牙髓,Hertwig上皮根鞘則作為牙根形成的誘導(dǎo)者和調(diào)節(jié)者,調(diào)節(jié)牙根大小、形狀和牙根數(shù)。學(xué)者發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)牙根及牙周組織發(fā)育的信號(hào)分子,如BMP、同源異型盒基因家族Msx和Shh、FGF、 GDF均定位于發(fā)育期的根端組織。推測(cè)可能通過細(xì)胞-細(xì)胞及細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用并由此產(chǎn)生的信號(hào)分子使牙根和牙周組織形成細(xì)胞的前體細(xì)胞分化,從而促成牙根和牙周組織的形態(tài)發(fā)生。牙齒萌出前,牙囊包圍著成釉器與牙乳頭組織。然而在牙齒萌出后,牙囊僅居于發(fā)育期牙根根端,與牙乳頭相連,兩種組織間失去了牙胚發(fā)育早期所存在的組織學(xué)分界�？紤]到牙根、牙周組織在發(fā)育上的同步性以及二者功能上的完整性,學(xué)者將發(fā)育期的牙根根端組織命名為“根端發(fā)育復(fù)合體”(developing apical complex, DAC)。學(xué)者將SD大鼠DAC與陶瓷化骨混合后,移植到大鼠腎包膜下,4W后可見牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)、牙周膜及骨樣組織形成。由此推測(cè)DAC在牙根發(fā)育時(shí)期,不僅繼續(xù)形成牙根,同時(shí)也形成牙周組織,以建立結(jié)構(gòu)完整的牙根／牙周復(fù)合體,從而行使咀嚼功能。學(xué)者利用小型豬動(dòng)物模型,外科手術(shù)去除牙根發(fā)育初期的牙乳頭后,盡管牙髓組織完整,但牙根停止發(fā)育；相比之下,含有牙乳頭的其它牙根生長(zhǎng)和發(fā)育均正常。由此推測(cè)牙乳頭在牙根發(fā)育中起著重要作用。牙乳頭作為“根端發(fā)育復(fù)合體”的一部分,其單獨(dú)作用,是否也能形成牙周組織呢? 本課題從人未發(fā)育完全的年輕恒牙中分離培養(yǎng)SCAP和牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs),并分別測(cè)定其克隆形成率、細(xì)胞增殖能力,并于體外誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,觀察其礦化和向脂肪細(xì)胞分化的能力,以及測(cè)定其在體外是否表達(dá)牙周膜相關(guān)標(biāo)志,觀察SCAP在體外是否表現(xiàn)牙周特性。旨在探索來自發(fā)育中組織的SCAP,是否與根尖區(qū)牙周組織的形成有密切聯(lián)系,為牙根及牙周組織共同發(fā)育機(jī)制提供一定的依據(jù)。 方法 1、SCAP與PDLSCs的收集和培養(yǎng) 選取16-20歲健康患者牙根未發(fā)育完全(牙根發(fā)育2/3)的阻生智齒,依據(jù)Tanaka等的實(shí)驗(yàn)方法,采用組織貼塊法培養(yǎng)細(xì)胞。將從同一顆牙切取的牙乳頭組織和牙周膜組織充分剪碎后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。 2、免疫熒光檢測(cè)干細(xì)胞表面標(biāo)志STRO-1 分別取第1代的兩種干細(xì)胞,用免疫熒光法檢測(cè)兩種干細(xì)胞是否表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志STRO-1。 3、SCAP與PDLSCs(?)細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 在6孔板中按200個(gè)細(xì)胞/孔的密度分別接種第1代的兩種干細(xì)胞,連續(xù)培養(yǎng)10d后,結(jié)晶紫染色觀察細(xì)胞克隆數(shù)。 4、SCAP與PDLSCs生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 分別取第2代SCAP和PDLSCs的單細(xì)胞懸液,MTT法測(cè)各孔OD值,連續(xù)測(cè)8天,以時(shí)間為橫軸、每天的平均OD值為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線。 5、SCAP與PDLSCs的礦化能力 取第3代兩類干細(xì)胞,在礦化誘導(dǎo)液中分別誘導(dǎo)7d、14d和21d后,茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況,免疫熒光染色法檢測(cè)礦化相關(guān)標(biāo)志物ALP、BSP和OC的表達(dá)情況,以及熒光定量PCR檢測(cè)這三種標(biāo)志物在兩種干細(xì)胞中的表達(dá)差異。兩類干細(xì)胞在普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)60d后,茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況以及熒光定量PCR檢測(cè)礦化相關(guān)標(biāo)志物在兩種干細(xì)胞中的表達(dá)差異。 6、SCAP與PDLSCs的成脂誘導(dǎo)分化 取第3代兩類干細(xì)胞,在成脂誘導(dǎo)液中分別誘導(dǎo)21d后,油紅O染色觀察脂滴形成情況。 7、SCAP與PDLSCs細(xì)胞膜片的制備 取第3代兩類干細(xì)胞,在含維生素C的誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)14d后,光鏡下觀察細(xì)胞外基質(zhì)形成情況。剝離細(xì)胞膜片,制成石蠟切片,HE染色觀察細(xì)胞膜片形態(tài)。 8、RT-PCR檢測(cè)SCAP與PDLSCs的牙周膜標(biāo)志物 分別取兩類干細(xì)胞的第3、5、7、9代,RT-PCR檢測(cè)牙周膜標(biāo)志物S100A4和periostin。 9、經(jīng)礦化誘導(dǎo)后S100A4的變化 熒光定量PCR檢測(cè)SCAP與PDLSCs在礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)21d后,S100A4與誘導(dǎo)前的變化。 10、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)進(jìn)行兩個(gè)樣本t檢驗(yàn),結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,p0.05表示差異有顯著意義。 結(jié)果 1、細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況 細(xì)胞約5-7d從組織塊周圍爬出,兩種細(xì)胞形態(tài)相似,均呈短梭、多角形。傳代后細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞大小和形態(tài)趨近一致。 2、免疫熒光檢測(cè)干細(xì)胞表面標(biāo)志STRO-1 第1代SCAP和PDLSCs均陽性表達(dá)STRO-1。 3、SCAP與PDLSCs細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) SCAP和PDLSCs均能形成克隆細(xì)胞團(tuán),SCAP形成的克隆數(shù)高于PDLSCso 4、SCAP與PDLSCs生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 兩種干細(xì)胞在第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,SCAP的增殖活力明顯強(qiáng)于PDLSCs。 5 SCAP與PDLSCs的礦化能力 兩種干細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后,細(xì)胞復(fù)層生長(zhǎng)、聚集成簇,茜素紅染色均可見鈣結(jié)節(jié)形成,隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加,鈣結(jié)節(jié)逐漸增多。免疫熒光顯示兩種干細(xì)胞均陽性表達(dá)礦化相關(guān)標(biāo)志物ALP, BSP和OC,熒光定量PCR顯示這三種標(biāo)志物在SCAP中的表達(dá)均高于PDLSCs.細(xì)胞在普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)60d后,茜素紅染色均陽性,且SCAP中ALP, BSP和OC的基因表達(dá)均高于PDLSCs。 6、SCAP與PDLSCs的成脂誘導(dǎo)分化 SCAP和PDLSCs在成脂誘導(dǎo)體系的作用下,21d左右可見細(xì)胞中出現(xiàn)串珠樣透明高亮度點(diǎn),并有部分融合,油紅-O染色呈陽性。 7、SCAP與PDLSCs細(xì)胞膜片的形成 SCAP和PDLSCs經(jīng)誘導(dǎo)14d后,大量細(xì)胞外基質(zhì)形成,成熟膜片形成,組織學(xué)檢查顯示兩種膜片較為均勻,細(xì)胞間富含大量的細(xì)胞外基質(zhì)。 8、RT-PCR檢測(cè)：SCAP與PDLSCs的牙周膜標(biāo)志物 RT-PCR顯示第3、5、7、9代的兩種干細(xì)胞均表達(dá)牙周膜標(biāo)志物S100A4和periostin。 9、經(jīng)礦化誘導(dǎo)后S100A4的變化 經(jīng)礦化誘導(dǎo)后,S100A4在SCAP和PDLSCs表達(dá)均下降。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)SCAP與PDLSCs,兩種細(xì)胞具有干細(xì)胞特性,表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物,且具有礦化、成脂分化的能力。SCAP的克隆形成能力、細(xì)胞增殖能力和礦化能力均高于PDLSCs。與PDLSCs一樣,SCAP也表達(dá)牙周膜相關(guān)標(biāo)志物,證實(shí)SCAP在體外表現(xiàn)牙周特性。SCAP也許可作為組織工程牙周再生的干細(xì)胞來源。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R781.05

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本文編號(hào)：2680021