【摘要】：[背景與目的]神經(jīng)嵴細胞(neural crest cells，NCCs)具有多向分化潛能特性，可分化為不同類型的成體細胞和組織。毛囊和牙齒的形態(tài)發(fā)育均起始于上皮與間充質(zhì)之間的交互作用。特別對于毛囊而言，這種交互作用一直從胚胎期持續(xù)到成年。因此，利用毛囊區(qū)神經(jīng)嵴細胞作為種子細胞應用于牙齒再生引起了廣泛的關(guān)注。Wnt信號通路在維持干細胞多分化潛能的過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本研究通過氯化鋰（Lithium Chloride，LiCl）內(nèi)源性激活NCCs的Wnt/β-catenin信號通路，探討其對NCCs增殖活性及成牙分化能力的影響。 [方法]分離培養(yǎng)小鼠觸須墊毛囊區(qū)NCCs，，利用細胞免疫熒光檢測鑒定細胞表型。流式細胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）檢測不同濃度LiCl作用不同時間后對NCCs細胞周期的影響，篩選最佳濃度及作用時間；20mM LiCl刺激NCCs24h后，蛋白免疫印跡法（Western blot）和細胞免疫熒光法檢測β-catenin在細胞內(nèi)累積情況,實時定量PCR（Real time PCR）檢測干細胞多潛能轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、klf4、Sox2、Nanog的表達情況。體外分離培養(yǎng)出生后兩天小鼠牙胚細胞(Tooth germcells，TGCs)，獲取牙胚細胞條件培養(yǎng)基(Tooth germ cell condition culture medium，TGC-CM)。用TGC-CM誘導培養(yǎng)NCCs，相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及排列方式變化。誘導培養(yǎng)7天后，利用細胞免疫熒光和Western blot檢測牙本質(zhì)涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP），牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（dentin matrix protein1，DMP1）及Runx2的表達情況。 [結(jié)果]1）神經(jīng)嵴細胞標記物Nestin、p75、Sox10及間充質(zhì)細胞的標記物Vimentin在從小鼠觸須墊區(qū)所分離的細胞中陽性表達；上皮細胞標記物keratins8陰性表達。2）20mM LiCl處理NCCs24h后，處于S期的細胞數(shù)百分比高于其他各組，細胞周期蛋白CyclinD1和CylinE1表達量明顯升高。3）LiCl刺激NCCs后β-catenin在NCCs內(nèi)的含量升高同時在核內(nèi)積聚。Real time PCR檢測顯示LiCl刺激NCCs后Oct-4、klf4、Sox2、Nanog的表達量較對照組表達升高。4）NCCs在TGC-CM誘導下形態(tài)伸長,極性排列;呈現(xiàn)較明顯的分化狀態(tài)。5）NCCs在TGC-CM誘導后可檢測到成牙本質(zhì)細胞相關(guān)基因DSP、DMP1及Runx2表達，LiCl刺激NCCs后用TGC-CM誘導，DSP、DMP1及Runx2表達明顯增強。 [結(jié)論]本實驗結(jié)果證明同通過LiCl的刺激可提高NCCs增殖活性，并一定程度上促進其去分化。NCCs在TGC-CM誘導下牙向分化，并在LiCl作用下成牙分化能力增強，證實激活Wnt/β-catenin信號通路可提高NCCs的成牙分化能力。
【圖文】：

圖 1 小鼠毛囊區(qū) NCCs 生長特點及形態(tài)圖 1A 表示組織塊貼壁 24h 后細胞形態(tài)及分布狀況，細胞向外遷移。圖 1B 表示傳至第三代細胞形態(tài)及分布情況，細胞保持梭形狀態(tài)，呈旋渦狀排列。（相差顯微鏡 40×）2.2 細胞特性鑒定所獲取細胞培養(yǎng)至第三代，利用細胞免疫熒光檢測神經(jīng)嵴細胞特異性標記物、間充質(zhì)干細胞標記物及上皮細胞特異性標記物檢測細胞來源及性質(zhì)。神經(jīng)嵴細胞特異性標記物巢蛋白Nestin、神經(jīng)營養(yǎng)因子受體p75和細胞發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Sox10陽性表達，間充質(zhì)干細胞特異性標記物波形蛋白Vimentin 在細胞中陽性表達，而上皮細胞標記物keratins 8在細胞中陰性表達（圖2）。說明本實驗成功分離培養(yǎng)細胞為神經(jīng)嵴來源，可用于接下來的研究。

18圖 2 NCCs 表型標記分子檢測第三代細胞表現(xiàn)為陽性表達神經(jīng)嵴特異性標記分子 Nestin、p75、Sox10 及間充質(zhì)特異性標記分子 Vimentin，上皮細胞特異性標記分子 keratins 8 陰性表達。紅色熒光表示標記物，藍色熒光表示 DAPI 核定位。（正置熒光顯微鏡 200×,圖中標尺表示 100um）
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R783.4

【參考文獻】

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1 顧新豐;蔣W

本文編號：2670189