【摘要】：[背景與目的]神經(jīng)嵴細(xì)胞(neural crest cells，NCCs)具有多向分化潛能特性，可分化為不同類型的成體細(xì)胞和組織。毛囊和牙齒的形態(tài)發(fā)育均起始于上皮與間充質(zhì)之間的交互作用。特別對(duì)于毛囊而言，這種交互作用一直從胚胎期持續(xù)到成年。因此，利用毛囊區(qū)神經(jīng)嵴細(xì)胞作為種子細(xì)胞應(yīng)用于牙齒再生引起了廣泛的關(guān)注。Wnt信號(hào)通路在維持干細(xì)胞多分化潛能的過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本研究通過氯化鋰（Lithium Chloride，LiCl）內(nèi)源性激活NCCs的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，探討其對(duì)NCCs增殖活性及成牙分化能力的影響。 [方法]分離培養(yǎng)小鼠觸須墊毛囊區(qū)NCCs，，利用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)鑒定細(xì)胞表型。流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)不同濃度LiCl作用不同時(shí)間后對(duì)NCCs細(xì)胞周期的影響，篩選最佳濃度及作用時(shí)間；20mM LiCl刺激NCCs24h后，蛋白免疫印跡法（Western blot）和細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)β-catenin在細(xì)胞內(nèi)累積情況,實(shí)時(shí)定量PCR（Real time PCR）檢測(cè)干細(xì)胞多潛能轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、klf4、Sox2、Nanog的表達(dá)情況。體外分離培養(yǎng)出生后兩天小鼠牙胚細(xì)胞(Tooth germcells，TGCs)，獲取牙胚細(xì)胞條件培養(yǎng)基(Tooth germ cell condition culture medium，TGC-CM)。用TGC-CM誘導(dǎo)培養(yǎng)NCCs，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及排列方式變化。誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，利用細(xì)胞免疫熒光和Western blot檢測(cè)牙本質(zhì)涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP），牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（dentin matrix protein1，DMP1）及Runx2的表達(dá)情況。 [結(jié)果]1）神經(jīng)嵴細(xì)胞標(biāo)記物Nestin、p75、Sox10及間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物Vimentin在從小鼠觸須墊區(qū)所分離的細(xì)胞中陽性表達(dá)；上皮細(xì)胞標(biāo)記物keratins8陰性表達(dá)。2）20mM LiCl處理NCCs24h后，處于S期的細(xì)胞數(shù)百分比高于其他各組，細(xì)胞周期蛋白CyclinD1和CylinE1表達(dá)量明顯升高。3）LiCl刺激NCCs后β-catenin在NCCs內(nèi)的含量升高同時(shí)在核內(nèi)積聚。Real time PCR檢測(cè)顯示LiCl刺激NCCs后Oct-4、klf4、Sox2、Nanog的表達(dá)量較對(duì)照組表達(dá)升高。4）NCCs在TGC-CM誘導(dǎo)下形態(tài)伸長,極性排列;呈現(xiàn)較明顯的分化狀態(tài)。5）NCCs在TGC-CM誘導(dǎo)后可檢測(cè)到成牙本質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因DSP、DMP1及Runx2表達(dá)，LiCl刺激NCCs后用TGC-CM誘導(dǎo)，DSP、DMP1及Runx2表達(dá)明顯增強(qiáng)。 [結(jié)論]本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明同通過LiCl的刺激可提高NCCs增殖活性，并一定程度上促進(jìn)其去分化。NCCs在TGC-CM誘導(dǎo)下牙向分化，并在LiCl作用下成牙分化能力增強(qiáng)，證實(shí)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路可提高NCCs的成牙分化能力。
【圖文】：

圖 1 小鼠毛囊區(qū) NCCs 生長特點(diǎn)及形態(tài)圖 1A 表示組織塊貼壁 24h 后細(xì)胞形態(tài)及分布狀況，細(xì)胞向外遷移。圖 1B 表示傳至第三代細(xì)胞形態(tài)及分布情況，細(xì)胞保持梭形狀態(tài)，呈旋渦狀排列。（相差顯微鏡 40×）2.2 細(xì)胞特性鑒定所獲取細(xì)胞培養(yǎng)至第三代，利用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)嵴細(xì)胞特異性標(biāo)記物、間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物及上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物檢測(cè)細(xì)胞來源及性質(zhì)。神經(jīng)嵴細(xì)胞特異性標(biāo)記物巢蛋白Nestin、神經(jīng)營養(yǎng)因子受體p75和細(xì)胞發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Sox10陽性表達(dá)，間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)記物波形蛋白Vimentin 在細(xì)胞中陽性表達(dá)，而上皮細(xì)胞標(biāo)記物keratins 8在細(xì)胞中陰性表達(dá)（圖2）。說明本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)細(xì)胞為神經(jīng)嵴來源，可用于接下來的研究。

18圖 2 NCCs 表型標(biāo)記分子檢測(cè)第三代細(xì)胞表現(xiàn)為陽性表達(dá)神經(jīng)嵴特異性標(biāo)記分子 Nestin、p75、Sox10 及間充質(zhì)特異性標(biāo)記分子 Vimentin，上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記分子 keratins 8 陰性表達(dá)。紅色熒光表示標(biāo)記物，藍(lán)色熒光表示 DAPI 核定位。（正置熒光顯微鏡 200×,圖中標(biāo)尺表示 100um）
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R783.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 顧新豐;蔣W

本文編號(hào)：2670189