【摘要】：目的：在獲得含目的基因pacA-ctxB、pacP-ctxB的轉(zhuǎn)基因番茄T0、T1、T2、T3代種子和轉(zhuǎn)基因生菜T0代種子的基礎(chǔ)上,應(yīng)用PCR技術(shù)、GUS染色技術(shù)對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的轉(zhuǎn)基因番茄后代植株進(jìn)行跟蹤檢測(cè),初步探索目的基因pacA-ctxB、pacP-ctxB在轉(zhuǎn)基因番茄后代植株中的遺傳穩(wěn)定性,并對(duì)報(bào)告基因gus和目的基因pacA-ctxB、pacP-ctxB的連鎖遺傳進(jìn)行初步分析,鑒定和篩選含目的基因的T1代轉(zhuǎn)基因生菜植株。 方法：本試驗(yàn)包括三部分 第一部分：防齲用轉(zhuǎn)基因番茄后代植株中外源目的基因穩(wěn)定性檢測(cè) 提取轉(zhuǎn)pacA-ctxB、pacP-ctxB基因番茄T1、T2、T3、T4代植株幼苗期、開(kāi)花期、果實(shí)成熟期總DNA,利用PCR技術(shù)檢測(cè)和鑒定含有外源目的基因pacA-ctxB、pacP-ctxB的轉(zhuǎn)基因番茄植株,每代種植11株植株。 第二部分：防齲用轉(zhuǎn)基因番茄后代植株中報(bào)告基因gus和目的基因的連鎖遺傳 1、采集轉(zhuǎn)基因番茄和非轉(zhuǎn)基因番茄植株幼根組織,通過(guò)組織化學(xué)染色定位法檢測(cè)轉(zhuǎn)pacA-ctxB、pacP-ctxB基因番茄后代群體T1、T2、T3、T4代植株中的gus基因。 2、采集轉(zhuǎn)基因番茄和非轉(zhuǎn)基因番茄植株葉片提取總DNA進(jìn)行PCR檢測(cè),篩選含外源目的基因pacA-ctxB、pacP-ctxB的轉(zhuǎn)基因番茄植株。 第三部分：防齲用T1代轉(zhuǎn)基因生菜中目的基因pacA-ctxB、pacP-ctxB的檢測(cè) 提取轉(zhuǎn)pacA-ctxB、pacP-ctxB基因生菜T1代植株總DNA,PCR法鑒定轉(zhuǎn)pacA-ctxB、pacP-ctxB基因生菜T1代植株。 結(jié)果：①提取含pacA-ctxB的T1、T2、T3、T4代轉(zhuǎn)基因番茄總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,幼苗期每代轉(zhuǎn)基因番茄植株分別有9、9、8、9株得到大小約為450bp的條帶,與陽(yáng)性對(duì)照一致,陽(yáng)性檢測(cè)率分別為81.8%、81.8%、72.7%、81.8%,開(kāi)花期和果實(shí)成熟期檢測(cè)結(jié)果與幼苗期一致。②含pacP-ctxB的T1、T2、T3、T4代轉(zhuǎn)基因番茄幼苗期每代植株分別有9、8、8、7株得到大小約為506bp的條帶,與陽(yáng)性對(duì)照一致,陽(yáng)性檢測(cè)率分別為81.8%、72.7%、72.7%、63.6%,開(kāi)花期和果實(shí)成熟期檢測(cè)結(jié)果與幼苗期一致。③轉(zhuǎn)pacA-ctxB基因番茄T1、T2、T3、T4代植株中分別有9、9、8、9株GUS染色為陽(yáng)性,gus基因陽(yáng)性株數(shù)與pacA-ctxB基因陽(yáng)性株數(shù)完全一致,吻合率為100%,轉(zhuǎn)pacP-ctxB基因番茄T1、T2、T3、T4植株中分別有9、8、8、7株GUS染色為陽(yáng)性,gus基因陽(yáng)性株數(shù)與pacP-ctxB基因陽(yáng)性株數(shù)完全一致,吻合率為100%。④提取10株轉(zhuǎn)pacA-ctxB基因生菜植株總DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增、電泳后,有6株見(jiàn)約450bp擴(kuò)增條帶,與陽(yáng)性對(duì)照一致；10株轉(zhuǎn)pacP-ctxB基因生菜植株總DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增、電泳后,有6株見(jiàn)約506bp擴(kuò)增條帶,與陽(yáng)性對(duì)照一致,其余植株和正常對(duì)照植株未有擴(kuò)增條帶。 結(jié)論：①外源基因pacA-ctxB、pacP-ctxB整合進(jìn)番茄基因組中,并且能夠在轉(zhuǎn)基因番茄的后代中穩(wěn)定的遺傳。②報(bào)告基因gus和目的基因pacA-ctxB、pacP-ctxB在T-DNA中緊密連鎖遺傳,報(bào)告基因gus可用于研究pacA-ctxB、pacP-ctxB基因的遺傳。③PCR法對(duì)轉(zhuǎn)基因生菜植株進(jìn)行檢測(cè),獲得了含pacA-ctxB、pacP-ctxB基因的T1代轉(zhuǎn)基因生菜植株。
【圖文】：

圖1.pEAC10和pEPC10的酶切結(jié)果Fig.1ThedigestionresultsofPEAC10andPEPC10:DNAhindlllMarkerZ:pEAclo總J貢粒3、4:pEACIO雙酶切:DNADLZ000Marker6、7:pEPe一。雙酶叨8:pEpCIO總質(zhì)粒

日的從因j遺傳傳遞的初步分析3.3轉(zhuǎn)基因番茄植株的獲得轉(zhuǎn)基因植株的培育過(guò)程(見(jiàn)圖2)，將轉(zhuǎn)基因番茄T。、TI、TZ、T:代種子在仁壤中培育發(fā)芽(圖ZA)，發(fā)芽至芽長(zhǎng)scm后移栽單獨(dú)生長(zhǎng)2周后再移至大田(圖ZB)，大約在種植30天左丫。)l:始開(kāi)花(圖ZC)，在90天左右番茄陸續(xù)成熟(圖ZD)。圖2轉(zhuǎn)基因番茄的培育 FigZTheeultivationofTransgenietomatosA育苗期C少千花期B幼曲期D成熟期3.4轉(zhuǎn)基因番茄后代植株目的基因PCR檢測(cè)結(jié)果3.4.1轉(zhuǎn)p““一c坎B基因番茄植株幼苗期、開(kāi)花期、果實(shí)成熟期目的基因PcR檢測(cè)結(jié)果 3.4.1.1提取T}、T:、T:、T;代轉(zhuǎn)產(chǎn)孤」-C眾召基因番茄幼苗期植株時(shí)‘少}‘總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別有9、9、8、9株得到大小約為450bp的特異性條帶，與陽(yáng)性對(duì)照一致。TI代植株第8、9株未檢測(cè)到LI的條帶，，T:代第6、9株未檢測(cè)到目的條帶
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R781.1

【參考文獻(xiàn)】

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4 黃曉t

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