【摘要】：研究背景 糞腸球菌為革蘭陽性兼性厭氧菌,它是再感染根管中檢出率最高的細(xì)菌,在根管治療失敗及難治性根尖周炎中扮演著重要的角色。根管系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,存在機械預(yù)備與化學(xué)預(yù)備無法到達的部位,要完全清除根管系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)菌是不可能的。因此為防止根管再感染的發(fā)生,抑制根管內(nèi)糞腸球菌生物膜再形成,維持根管系統(tǒng)內(nèi)糞腸球菌數(shù)量低于致病量尤其重要。目前有關(guān)沖洗液性能的研究多集中于沖洗液殺菌性能的研究,有關(guān)沖洗液殘余抗菌活性的研究較少�，F(xiàn)今多用浸泡方法構(gòu)建糞腸球菌感染模型,基于此模型的局限性,未能用激光共聚焦掃描顯微鏡等較快捷直觀的方法,研究根管沖洗液殘余對牙本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌的抑制能力。近年有學(xué)者提出用離心方法構(gòu)建牙本質(zhì)感染模型,此方法建立的感染模型進入牙本質(zhì)內(nèi)的細(xì)菌更多,用于評價沖洗液滅菌性能結(jié)果更可靠。結(jié)合新的感染模型可更準(zhǔn)確評價沖洗液殘抑制糞腸球菌能力。 研究目的 本課題通過激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy)觀察各沖洗液處理牙本質(zhì)樣本后,24h樣本表面殘留沖洗液對糞腸球菌生物膜形成的影響。選擇出24h內(nèi),抑制細(xì)菌生物膜形成效果最好的根管沖洗液,然后用離心的方法,建立糞腸球菌感染模型,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察根管沖洗液處理此感染模型0d、7d后牙本質(zhì)小管中糞腸球菌活菌情況。從牙本質(zhì)表面與牙本質(zhì)小管,兩方面觀察根管沖洗液抑制細(xì)菌生物膜形成情況,評價其殘余抗菌活性,為臨床選擇控制糞腸球菌感染藥物提供實驗依據(jù)。 材料和方法 1.不同沖洗液殘余藥對牙本質(zhì)表面糞腸球菌生物膜形成影響 糞腸球菌復(fù)蘇、厭氧培養(yǎng)與細(xì)菌鑒定,繪制糞腸球菌24h生長曲線。制備4mm×4mm×0.5mm牙本質(zhì)片樣本60個隨機分成6組,樣本分別浸泡于0.9%生理鹽水(陰性對照組)、5.25%、2.5%次氯酸鈉溶液、17%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液10%檸檬酸溶液和2%氯己定溶液中3min,隨后將樣本移入24孔板中,分別注入400μl預(yù)備好的糞腸球菌細(xì)菌懸液,厭氧培養(yǎng)24h,經(jīng)LIVE/DEAD BacLight熒光染色后激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)菌生物膜形成情況,60倍水鏡觀察樣本,每個樣本隨機抽取2個區(qū)域由內(nèi)向外掃描獲取X、Y、Z軸圖像。共得120個區(qū)域掃描圖片。Imaris7.2.3軟件獲取三維重建圖片Bioimage-L軟件統(tǒng)計三維重組圖像活菌體積,SPSS13.0處理數(shù)據(jù),各組生物膜觀測指標(biāo)間進行隨機區(qū)組單因素方差分析(one-way ANOVA), SNK(Student-Neuman-Keuls)進行均數(shù)兩兩比較。獲取每組平均活菌體積與陰性對照組平均活菌體積相比計算每組沖洗液平均抑制細(xì)菌生物膜形成比率。 2.離心法構(gòu)建牙本質(zhì)塊糞腸球菌感染模型 選擇因正畸拔除的健康前磨牙17顆,于釉牙骨質(zhì)界下截取4mm長圓柱狀牙本質(zhì)塊,GG鉆擴大根管,縱向劈開,600目水磨砂紙去除牙骨質(zhì),并調(diào)整牙本質(zhì)樣本厚度,為2mm低速球鉆調(diào)整樣本寬度,使其與超濾離心管大小一致。最后制備33個4mm×4mm×2mm大小,半圓柱狀牙本質(zhì)塊樣本,去除牙本質(zhì)塊表面玷污層,隨機抽取1個樣本電鏡觀察玷污層去除情況。確定玷污層去除干凈后,樣本置于超濾離心管中,樹脂封閉樣本與管壁間隙。為檢驗定速離心的方法是否能使液體進入牙本質(zhì)小管,先檢驗用定速離心的方法能否使結(jié)晶紫染料進入牙本質(zhì)小管中,隨機抽取5個預(yù)備好的牙本質(zhì)塊樣本,加入結(jié)晶紫溶液后,按以下離心速度順次離心1400g,2000g,3600g,和5600g,每次離心5min共離心兩次,在每次離心中均去除滲出的結(jié)晶紫溶液,并加入新鮮結(jié)晶紫溶液。在另外5個牙本質(zhì)塊樣本中加入結(jié)晶紫溶液靜置24h。觀察離心法是否能使染色液透過牙本質(zhì)塊。確定定速離心的方法有效后,隨機抽取2個預(yù)備好的樣本,加入糞腸球菌懸液,按上述離心法離心,吖啶橙染色液染色后倒置熒光顯微鏡觀察。確定模型建立成功后將剩下的20個樣本隨機分成兩組：A組加入糞腸球菌菌液后,按上述方法順次定速離心；B組為空白對照組加入BHI液體培養(yǎng)基后順次定速離心；兩組分別隨機抽取一半樣本置于掃描電鏡下觀察,另一半樣本經(jīng)LIVE/DEAD BacLight熒光染色后,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。 3.沖洗液殘余藥量對本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌生長的影響 選擇因正畸拔除的健康前磨牙6顆,按上述方法制備牙本質(zhì)塊樣本。共制備12例4mm×4mm×2mm大小半圓柱狀牙本質(zhì)塊樣本,加入糞腸球菌菌液,按上述離心方法離心。將預(yù)備好的樣本隨機分成四組：5.25%次氯酸鈉溶液0d組、5.25%次氯酸鈉溶液7d組；2%氯己定溶液0d組,2%氯己定溶液7d組。樣本分別經(jīng)5.25%次氯酸鈉溶液,與2%氯己定溶液處理。抽取0d組樣本,經(jīng)LIVE/DEAD BacLight熒光染色后激光共聚焦掃描顯微鏡觀察,每個樣本隨機抽取2個區(qū)域觀察。剩下的7d組樣本置于厭氧菌培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)7d后取出,LIVE/DEAD染色后,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察樣本牙本質(zhì)內(nèi)細(xì)菌清除情況。Imaris7.2.3軟件獲取三維重建圖片,Bioimage-L軟件統(tǒng)計三維重組圖像活菌體積計算每組樣本活菌比例,SPSS13.0處理數(shù)據(jù)。 結(jié)果 1.24h內(nèi)細(xì)菌生長曲線圖顯示,16h進入了穩(wěn)定期。各組沖洗液對糞腸球菌生物膜均有不同程度的抑制作用。2%氯己定溶液組活菌數(shù)最少,能抑制99.9%細(xì)菌生物膜形成,次氯酸鈉溶液組活菌數(shù)多,抑制細(xì)菌生物膜形成能力最差分別抑制13.3%、18.8%細(xì)菌生物膜形成,17%乙二胺四乙酸溶液與10%檸檬酸溶液抑制細(xì)菌生物膜形成能力次于2%氯己定溶液組,分別能抑制43.8%與45.3%細(xì)菌生物膜形成。 2.成功建立糞腸球菌感染模型。定速離心組,見結(jié)晶紫染料從牙本質(zhì)髓腔面滲透到牙骨質(zhì)面,浸泡組牙本質(zhì)表層髓腔面呈深紫色,深層牙本質(zhì)組織清潔未見任何紫色染料存在。表明,離心方可以使結(jié)晶紫染色液透過牙本質(zhì),同樣菌液也可以透過牙本質(zhì)。熒光顯微鏡結(jié)果與激光共聚焦掃描顯微鏡觀察結(jié)果,均顯示,牙本質(zhì)樣本中有大量長短不一的綠色熒光。激光共聚焦掃描顯微鏡下,大部分牙本質(zhì)小管被細(xì)菌浸潤,屬于重度感染模型�？瞻讓φ战M未見有細(xì)菌浸潤,僅見少量零散淺綠色熒光。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示：牙本質(zhì)塊髓腔面,可見大量糞腸球菌成團塊狀聚集于牙本質(zhì)小管口,并浸潤到牙本質(zhì)小管內(nèi),牙本質(zhì)小管內(nèi)見大量細(xì)菌浸潤,大部分細(xì)菌形態(tài)規(guī)則,陰性對照組未見細(xì)菌浸潤,牙本質(zhì)小管通暢,結(jié)構(gòu)清晰,膠原纖維交織成網(wǎng)并嵌入管壁。 3.結(jié)果顯示,5.25%次氯酸鈉溶液7d組活菌體積較5.25%次氯酸鈉溶液0d組多,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),2%氯己定溶液0d組活菌體積與2%氯己定溶液7d組相比無明顯差異(P0.05),表明,2%氯己定殘余藥液在7d內(nèi)對牙本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌具有一定程度的抑制作用；5.25%次氯酸鈉殘余藥液在7d內(nèi)對牙本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌未顯示出抑制作用。 結(jié)論 五種根管沖洗液24h內(nèi),均不同程度抑制牙本質(zhì)表面糞腸球菌細(xì)菌生物膜形成,其中2%氯己定溶液能力最強,次氯酸鈉最弱。離心方法建立的牙本質(zhì)塊糞腸球菌感染模型,細(xì)菌能浸潤牙本質(zhì)小管并侵入牙本質(zhì)小管深部。2%氯己定溶液7d內(nèi)可持續(xù)抑制牙本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌生長。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R781.05

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本文編號：2666445