【摘要】：研究背景 糞腸球菌為革蘭陽(yáng)性兼性厭氧菌,它是再感染根管中檢出率最高的細(xì)菌,在根管治療失敗及難治性根尖周炎中扮演著重要的角色。根管系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,存在機(jī)械預(yù)備與化學(xué)預(yù)備無(wú)法到達(dá)的部位,要完全清除根管系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)菌是不可能的。因此為防止根管再感染的發(fā)生,抑制根管內(nèi)糞腸球菌生物膜再形成,維持根管系統(tǒng)內(nèi)糞腸球菌數(shù)量低于致病量尤其重要。目前有關(guān)沖洗液性能的研究多集中于沖洗液殺菌性能的研究,有關(guān)沖洗液殘余抗菌活性的研究較少�，F(xiàn)今多用浸泡方法構(gòu)建糞腸球菌感染模型,基于此模型的局限性,未能用激光共聚焦掃描顯微鏡等較快捷直觀的方法,研究根管沖洗液殘余對(duì)牙本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌的抑制能力。近年有學(xué)者提出用離心方法構(gòu)建牙本質(zhì)感染模型,此方法建立的感染模型進(jìn)入牙本質(zhì)內(nèi)的細(xì)菌更多,用于評(píng)價(jià)沖洗液滅菌性能結(jié)果更可靠。結(jié)合新的感染模型可更準(zhǔn)確評(píng)價(jià)沖洗液殘抑制糞腸球菌能力。 研究目的 本課題通過激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy)觀察各沖洗液處理牙本質(zhì)樣本后,24h樣本表面殘留沖洗液對(duì)糞腸球菌生物膜形成的影響。選擇出24h內(nèi),抑制細(xì)菌生物膜形成效果最好的根管沖洗液,然后用離心的方法,建立糞腸球菌感染模型,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察根管沖洗液處理此感染模型0d、7d后牙本質(zhì)小管中糞腸球菌活菌情況。從牙本質(zhì)表面與牙本質(zhì)小管,兩方面觀察根管沖洗液抑制細(xì)菌生物膜形成情況,評(píng)價(jià)其殘余抗菌活性,為臨床選擇控制糞腸球菌感染藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料和方法 1.不同沖洗液殘余藥對(duì)牙本質(zhì)表面糞腸球菌生物膜形成影響 糞腸球菌復(fù)蘇、厭氧培養(yǎng)與細(xì)菌鑒定,繪制糞腸球菌24h生長(zhǎng)曲線。制備4mm×4mm×0.5mm牙本質(zhì)片樣本60個(gè)隨機(jī)分成6組,樣本分別浸泡于0.9%生理鹽水(陰性對(duì)照組)、5.25%、2.5%次氯酸鈉溶液、17%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液10%檸檬酸溶液和2%氯己定溶液中3min,隨后將樣本移入24孔板中,分別注入400μl預(yù)備好的糞腸球菌細(xì)菌懸液,厭氧培養(yǎng)24h,經(jīng)LIVE/DEAD BacLight熒光染色后激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)菌生物膜形成情況,60倍水鏡觀察樣本,每個(gè)樣本隨機(jī)抽取2個(gè)區(qū)域由內(nèi)向外掃描獲取X、Y、Z軸圖像。共得120個(gè)區(qū)域掃描圖片。Imaris7.2.3軟件獲取三維重建圖片Bioimage-L軟件統(tǒng)計(jì)三維重組圖像活菌體積,SPSS13.0處理數(shù)據(jù),各組生物膜觀測(cè)指標(biāo)間進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組單因素方差分析(one-way ANOVA), SNK(Student-Neuman-Keuls)進(jìn)行均數(shù)兩兩比較。獲取每組平均活菌體積與陰性對(duì)照組平均活菌體積相比計(jì)算每組沖洗液平均抑制細(xì)菌生物膜形成比率。 2.離心法構(gòu)建牙本質(zhì)塊糞腸球菌感染模型 選擇因正畸拔除的健康前磨牙17顆,于釉牙骨質(zhì)界下截取4mm長(zhǎng)圓柱狀牙本質(zhì)塊,GG鉆擴(kuò)大根管,縱向劈開,600目水磨砂紙去除牙骨質(zhì),并調(diào)整牙本質(zhì)樣本厚度,為2mm低速球鉆調(diào)整樣本寬度,使其與超濾離心管大小一致。最后制備33個(gè)4mm×4mm×2mm大小,半圓柱狀牙本質(zhì)塊樣本,去除牙本質(zhì)塊表面玷污層,隨機(jī)抽取1個(gè)樣本電鏡觀察玷污層去除情況。確定玷污層去除干凈后,樣本置于超濾離心管中,樹脂封閉樣本與管壁間隙。為檢驗(yàn)定速離心的方法是否能使液體進(jìn)入牙本質(zhì)小管,先檢驗(yàn)用定速離心的方法能否使結(jié)晶紫染料進(jìn)入牙本質(zhì)小管中,隨機(jī)抽取5個(gè)預(yù)備好的牙本質(zhì)塊樣本,加入結(jié)晶紫溶液后,按以下離心速度順次離心1400g,2000g,3600g,和5600g,每次離心5min共離心兩次,在每次離心中均去除滲出的結(jié)晶紫溶液,并加入新鮮結(jié)晶紫溶液。在另外5個(gè)牙本質(zhì)塊樣本中加入結(jié)晶紫溶液靜置24h。觀察離心法是否能使染色液透過牙本質(zhì)塊。確定定速離心的方法有效后,隨機(jī)抽取2個(gè)預(yù)備好的樣本,加入糞腸球菌懸液,按上述離心法離心,吖啶橙染色液染色后倒置熒光顯微鏡觀察。確定模型建立成功后將剩下的20個(gè)樣本隨機(jī)分成兩組：A組加入糞腸球菌菌液后,按上述方法順次定速離心；B組為空白對(duì)照組加入BHI液體培養(yǎng)基后順次定速離心；兩組分別隨機(jī)抽取一半樣本置于掃描電鏡下觀察,另一半樣本經(jīng)LIVE/DEAD BacLight熒光染色后,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。 3.沖洗液殘余藥量對(duì)本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌生長(zhǎng)的影響 選擇因正畸拔除的健康前磨牙6顆,按上述方法制備牙本質(zhì)塊樣本。共制備12例4mm×4mm×2mm大小半圓柱狀牙本質(zhì)塊樣本,加入糞腸球菌菌液,按上述離心方法離心。將預(yù)備好的樣本隨機(jī)分成四組：5.25%次氯酸鈉溶液0d組、5.25%次氯酸鈉溶液7d組；2%氯己定溶液0d組,2%氯己定溶液7d組。樣本分別經(jīng)5.25%次氯酸鈉溶液,與2%氯己定溶液處理。抽取0d組樣本,經(jīng)LIVE/DEAD BacLight熒光染色后激光共聚焦掃描顯微鏡觀察,每個(gè)樣本隨機(jī)抽取2個(gè)區(qū)域觀察。剩下的7d組樣本置于厭氧菌培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)7d后取出,LIVE/DEAD染色后,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察樣本牙本質(zhì)內(nèi)細(xì)菌清除情況。Imaris7.2.3軟件獲取三維重建圖片,Bioimage-L軟件統(tǒng)計(jì)三維重組圖像活菌體積計(jì)算每組樣本活菌比例,SPSS13.0處理數(shù)據(jù)。 結(jié)果 1.24h內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線圖顯示,16h進(jìn)入了穩(wěn)定期。各組沖洗液對(duì)糞腸球菌生物膜均有不同程度的抑制作用。2%氯己定溶液組活菌數(shù)最少,能抑制99.9%細(xì)菌生物膜形成,次氯酸鈉溶液組活菌數(shù)多,抑制細(xì)菌生物膜形成能力最差分別抑制13.3%、18.8%細(xì)菌生物膜形成,17%乙二胺四乙酸溶液與10%檸檬酸溶液抑制細(xì)菌生物膜形成能力次于2%氯己定溶液組,分別能抑制43.8%與45.3%細(xì)菌生物膜形成。 2.成功建立糞腸球菌感染模型。定速離心組,見結(jié)晶紫染料從牙本質(zhì)髓腔面滲透到牙骨質(zhì)面,浸泡組牙本質(zhì)表層髓腔面呈深紫色,深層牙本質(zhì)組織清潔未見任何紫色染料存在。表明,離心方可以使結(jié)晶紫染色液透過牙本質(zhì),同樣菌液也可以透過牙本質(zhì)。熒光顯微鏡結(jié)果與激光共聚焦掃描顯微鏡觀察結(jié)果,均顯示,牙本質(zhì)樣本中有大量長(zhǎng)短不一的綠色熒光。激光共聚焦掃描顯微鏡下,大部分牙本質(zhì)小管被細(xì)菌浸潤(rùn),屬于重度感染模型�？瞻讓�(duì)照組未見有細(xì)菌浸潤(rùn),僅見少量零散淺綠色熒光。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示：牙本質(zhì)塊髓腔面,可見大量糞腸球菌成團(tuán)塊狀聚集于牙本質(zhì)小管口,并浸潤(rùn)到牙本質(zhì)小管內(nèi),牙本質(zhì)小管內(nèi)見大量細(xì)菌浸潤(rùn),大部分細(xì)菌形態(tài)規(guī)則,陰性對(duì)照組未見細(xì)菌浸潤(rùn),牙本質(zhì)小管通暢,結(jié)構(gòu)清晰,膠原纖維交織成網(wǎng)并嵌入管壁。 3.結(jié)果顯示,5.25%次氯酸鈉溶液7d組活菌體積較5.25%次氯酸鈉溶液0d組多,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),2%氯己定溶液0d組活菌體積與2%氯己定溶液7d組相比無(wú)明顯差異(P0.05),表明,2%氯己定殘余藥液在7d內(nèi)對(duì)牙本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌具有一定程度的抑制作用；5.25%次氯酸鈉殘余藥液在7d內(nèi)對(duì)牙本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌未顯示出抑制作用。 結(jié)論 五種根管沖洗液24h內(nèi),均不同程度抑制牙本質(zhì)表面糞腸球菌細(xì)菌生物膜形成,其中2%氯己定溶液能力最強(qiáng),次氯酸鈉最弱。離心方法建立的牙本質(zhì)塊糞腸球菌感染模型,細(xì)菌能浸潤(rùn)牙本質(zhì)小管并侵入牙本質(zhì)小管深部。2%氯己定溶液7d內(nèi)可持續(xù)抑制牙本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌生長(zhǎng)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R781.05

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本文編號(hào)：2666445