【摘要】：口腔鱗狀細胞痛(oral squamous cell carcinoma, OSCC)常向頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,是導致患者療效不佳甚至死亡的主要原因之一。隨著OSCC的發(fā)展,癌組織內(nèi)大量新生血管形成,滲出增加,因缺乏淋巴管引流而致組織壓升高,并向周圍組織傳導,使癌周組織水腫逐漸加重,癌周毛細淋巴管為適應功能需要而代償性擴張,并出現(xiàn)大量開放的內(nèi)皮細胞間通道。加上痛周毛細淋巴管內(nèi)外壓力差,大量的組織液攜帶著脫落浸潤的腫瘤細胞等大分子或顆粒物質(zhì),經(jīng)過這些開放的內(nèi)皮通道進入毛細淋巴管,從而產(chǎn)生淋巴道轉(zhuǎn)移�？谇活M面部癌瘤一旦發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,其5年生存率將減少一半,研究OSCC發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后的診治具有重要現(xiàn)實意義。 目前尚無判斷OSCC發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的確切方法,對于已經(jīng)確診的OSCC,仍然采用以手術治療為主的多學科綜合治療。由于頜面部所處解剖位置及功能特點,為了徹底切除腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶,常會破壞患者的容貌,損壞患者的語言、進食、吞咽等重要功能,影響患者的生存質(zhì)量。利用OSCC發(fā)生后毛細淋巴管特征,將小分子量的抗痛藥物與大分子或顆粒物質(zhì)相結(jié)合后行癌周注射,使其通過內(nèi)皮細胞間通道和內(nèi)皮細胞的吞噬、胞飲作用進入癌周毛細淋巴管,然后通過淋巴引流到達區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶內(nèi),可實現(xiàn)對轉(zhuǎn)移痛細胞的靶向化療。 口腔癌原發(fā)灶常較表淺,方便在直視下行癌周粘膜或皮下注射,一方面可給藥治療轉(zhuǎn)移癌,具有局部藥物濃度高、避免肝臟的“首過效應”、降低全身毒副作用及避免血液中酶對藥效的破壞等優(yōu)點；另一方面可用診斷試劑顯示區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶,為手術導航。 平陽霉素(pingyangmycin, PYM)是中國自行開發(fā)和研制的抗腫瘤類抗生素,體外能明顯抑制人舌鱗痛細胞系Tca8113細胞生長,在頭頸部鱗癌的化療中使用較多。量子點(quantum dots, QDs)具備獨特的光電特征：寬且連續(xù)分布的激發(fā)光譜,窄且對稱分布的發(fā)射光譜,光強度較有機染料高10-20倍,能夠有效地消除組織或體液對光的吸收和背景干擾,具備抗光漂白性。聚乳酸羥基乙酸(polylactic-co-glycolic acid, PLGA)是經(jīng)美國食品藥品管理局(food and drug administration, FDA)批準可用于人體的生物材料,具備出色的生物相容性、生物降解性和機械強度。 本研究選擇PYM為模型藥物,QDs為熒光探針,PLGA為藥物載體,制備集靶向化療、定位、實時監(jiān)測多功能于一體的平陽霉素量子點聚乳酸羥基乙酸納米粒(nanoparticles, NPs)(PYM-QD-PLGA-NPs),并初步探討其對OSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的靶向性。 第一章平陽霉素量子點聚乳酸羥基乙酸納米粒的制備 目的 為了靶向治OSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶,制備一種集靶向化療、定位、實時監(jiān)測為一體的納米粒。 方法 1.以PYM為模型藥物、QDs為熒光探針、PLGA為載體,通過正交實驗設計,復乳法制備PYM-QD-PLGA-NPs。 2.測量PYM-QD-PLGA-NPs中PYM包封率和載藥率。 3.檢測(?)PYM-QD-PLGA-NPs的粒徑、表面電位。 4.對PYM-QD-PLGA-NPs、PYM、QDs、PLGA進行紅外光譜分析。 5.檢測(?)PYM-QD-PLGA-NPs的熒光性能。 6.探索PYM-QD-PLGA-NPs體外藥物釋放規(guī)律。 結(jié)果 1.正交設計實驗號4具有相對最高的載藥率(drug loading, DL)5.9±0.3%和包封率(embedding ratio, ER)78.1±2.1%。選取該方法制備的PYM-QD-PLGA-NPs進行后續(xù)實驗。 2.PYM-QD-PLGA-NPs平均粒徑為245.4nm,粒徑分布指數(shù)(partical size dispersibility index,PDI)為0.375±0.009,電位為-6.68±4.11mV。 3.紅外光譜圖提示PLGA位于PYM-QD-PLGA-NPs最外層,將QDs、PYM包裹在內(nèi)。 4.在熒光顯微鏡下,PYM-QD-PLGA-NPs具備QDs相似的紅色熒光,反向證明納米粒包裹有量子點。 5PYM-QD-PLGA-NPs在體外的藥物累積釋放百分率與Higuchi方程擬合,具有較好的藥物控制釋放效果。 第二章人舌鱗癌Tca8113細胞對平陽霉素量子點聚乳酸羥基乙酸納米粒的體外敏感性研究 目的 探討人舌鱗癌Tca8113細胞對PYM-QD-PLGA-NPs的體外攝取情況及敏感性。 方法 1.人舌鱗癌Tca8113細胞增殖曲線 Tca8113細胞以密度1000個/孔、2000個/孔、4000個/孔、6000個/孔、8000個/孔、10000個/孔接種于96孔培養(yǎng)板,每孔190gL培養(yǎng)基,分別于1、2、3、4、5、6、7天后MTS試劑檢測細胞增殖情況。 2.細胞攝取實驗 人舌鱗癌Tca8113細胞按104個/mL、每孔2mL接種于12孔培養(yǎng)板。2天后分別加入QDs和PYM-QD-PLGA-NPs各6孔,每隔1小時至12小時,熒光和自然光通道觀察同一視野細胞攝取情況。 3.藥物敏感性實驗 分為PYM、QDs、PLGA、PYM-QD-PLGA-NPs、對照組、調(diào)零組共6組,每干預因素組根據(jù)PYM濃度設5個濃度組：0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、10μg/mL、分別于加樣后1、2、3、4、5、6、7天,MTS試劑檢測細胞增殖情況。 4.數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析 應用SPSS16.0和Mcrosoft Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。藥物組間比較應用析因設計資料的方差分析,各實驗組間比較采用單向方差分析,兩組間多重比較采用Bonferroni法。假設檢驗為雙側(cè)檢驗,檢驗水準為a=0.05,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果 1.在190μL、10%血清培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板中,1000個/孔和2000個/孔Tca8113細胞接種密度在第七天仍然保持增殖狀態(tài)。 2.在相同培養(yǎng)條件及時間下,QDs和PYM-QD-PLGA-NPs均能被人舌鱗癌Tca8113細胞吞飲,PYM-QD-PLGA-NPs被吞飲的量明顯較QDs少。 3PYM-QD-PLGA-NPs和PYM抑制Tca8113細胞增殖的能力相似,且均具有濃度、時間依賴性。PLGA對Tca8113細胞增殖無明顯抑制作用,QDs對Tca8113細胞增殖有抑制作用但弱于PYM-QD-PLGA-NPs,即PYM-QD-PLGA-NPs對人舌鱗癌Tca8113細胞體外增殖的抑制能力部分來自于PYM。 第三章平陽霉素量子點聚乳酸羥基乙酸納米粒對口腔鱗狀細胞癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的靶向性評價 目的 初步評價PYM-QD-PLGA-NPs對OSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的靶向性。 方法 1.荷瘤動物模型 人舌鱗癌Tca8113細胞107個/mL在裸鼠頰粘膜下每部位注射0.2mL,定期觀察腫瘤生長情況。 2.動物活體成像 痛周頰粘膜下對稱四個部位共注射PYM-QD-PLGA-NPs(藥物濃度為100μg/mL)懸液0.2mL。每隔10分鐘至2小時,在小動物光學活體成像系統(tǒng)(激發(fā)波長488nm,發(fā)射波長610nm)下觀察NPs體內(nèi)分布的熒光影像。 3.組織塊(器官)及組織切片 注射PYM-QD-PLGA-NPs后12小時,處死裸鼠,取痛周組織、同側(cè)頸部淋巴結(jié),制備成組織塊(器官)或石蠟組織切片,以自然光和激發(fā)光通道同一視野觀察NPs分布情況。 結(jié)果 1.注射后10-15天,裸鼠頰部腫痛直徑達0.5cm以上,石蠟組織切片證實已形成頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)灶。 2.裸鼠OSCC痛周粘膜下注射PYM-QD-PLGA-NPs后2小時,小動物光學活體成像系統(tǒng)下同側(cè)頸部淋巴結(jié)區(qū)域具有癌周注射區(qū)相似熒光,提示部分NPs已經(jīng)自癌周轉(zhuǎn)移到頸部淋巴結(jié)。 3.組織塊(器官)照片示頸部淋巴結(jié)具有癌周組織相似紅色熒光,石蠟組織切片示癌周橫紋肌邊緣和頸部淋巴結(jié)髓竇、髓索均見散在的小圓球形紅色熒光,進一步證明了PYM-QD-PLGA-NPs已經(jīng)自痛周轉(zhuǎn)移到頸部淋巴結(jié)。 全文總結(jié) 1.經(jīng)正交實驗設計優(yōu)化制備的PYM-QD-PLGA-NPs藥物ER為78.1%±2.1%,DL為5.9%±0.29%,平均粒徑為245.4nm,PDI為0.375±0.009,電位-6.68±4.11mV,具備QDs相似的熒光性能和良好的藥物控制釋放效果。 2PYM-QD-PLGA-NPs能夠被人舌鱗癌Tca8113細胞攝取,但在相同時間段,攝取的量較QDs少。 3PYM-QD-PLGA-NPs和PYM抑制Tca8113細胞增殖的能力相似,且均具有濃度、時間依耐性。PLGA對Tca8113細胞增殖無明顯抑制作用,QDs對Tca8113細胞增殖有抑制作用但較PYM-QD-PLGA-NPs弱。 4.PYM-QD-PLGA-NPs經(jīng)裸鼠頰癌癌周粘膜下注射,小動物活體成像、組織塊(器官)熒光照片和石蠟組織切片熒光照片均證實PYM-QD-PLGA-NPs能夠靶向于OSCC頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶,為后續(xù)動物及臨床研究提供依據(jù)。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R739.8
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