【摘要】： 慢性牙周炎(chronic periodontitis, CP)是牙齒支持組織,包括牙齦、牙骨質(zhì)、牙周膜和牙槽骨因炎癥所致的一種疾病,是人類口腔的兩大類主要疾病之一,是導(dǎo)致成年人牙齒喪失的一個主要原因。目前CP的治療效果僅限于控制病癥,防止其進一步發(fā)展,然而對于因牙周病喪失的牙周組織難以再生。近年來的牙周組織工程的研究為喪失的牙周組織再生提供了可能,種子細胞、細胞因子和支架材料是牙周組織工程的三大要素。ZUK首先于2000年發(fā)現(xiàn)了脂肪干細胞,因其取材方便,再生能力強,在多種組織的再生中都有應(yīng)用,但脂肪干細胞在牙周組織再生中的應(yīng)用尚少;種子細胞需要細胞因子的誘導(dǎo)才能分化轉(zhuǎn)歸,富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)是全血經(jīng)過離心、分離而得到的血小板濃縮物,富含由血小板分泌的七種與所有創(chuàng)傷愈合過程有關(guān)的蛋白生長因子,在種子細胞的分化轉(zhuǎn)歸中起到了很重要的作用;納米羥基磷灰石/膠原是一種有機無機復(fù)合的支架材料,在牙周組織再生中起了促進作用。本課題研究Beagle犬的脂肪干細胞的獲得,鑒定及向成骨細胞轉(zhuǎn)化,研究其增殖分化過程中,PRP的作用,及脂肪干細胞與支架材料納米羥基磷灰石/膠原的生物相容性,為牙周組織工程篩選合適的種子細胞、細胞因子和支架材料組合提供實驗依據(jù);并將脂肪干細胞-PRP-納米羥基磷灰石/膠原復(fù)合物移植到動物實驗牙周缺損處,觀察該模式對牙周組織再生的作用。 目的:觀察脂肪干細胞的分離培養(yǎng)鑒定的方法及其向成體細胞轉(zhuǎn)化的能力,在脂肪干細胞礦化過程中觀察PRP對其礦化的影響,及脂肪干細胞與支架材料的生物相容性,研究脂肪干細胞-PRP-納米羥基磷灰石/膠原復(fù)合物對牙周組織再生的作用。探索脂肪干細胞作為牙周組織工程的種子細胞的可行性,為牙周組織工程篩選合適的種子細胞,細胞因子和支架材料提供實驗依據(jù)。 方法:酶消化法培養(yǎng)Beagle犬脂肪干細胞,用免疫組化SP法檢測CD44、CD29表達,鑒定其干細胞特性;將用改良法獲得的不同濃度的PRP作用于Beagle犬脂肪干細胞,觀察促進Beagle犬脂肪干細胞增殖的最佳濃度;將獲得的脂肪干細胞分別采用含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液、成骨細胞誘導(dǎo)液和添加PRP的成骨細胞誘導(dǎo)液培養(yǎng)脂肪干細胞,21天后經(jīng)Von Kossa染色,觀察脂肪干細胞向成骨細胞分化的能力及分化過程中PRP的作用;將脂肪干細胞與納米羥基磷灰石/膠原共培養(yǎng)7天,環(huán)境掃描電鏡觀察細胞在支架材料上的附著情況;將脂肪干細胞-PRP-納米羥基磷灰石/膠原復(fù)合物移植到動物實驗牙周缺損處,分別于4W,8W,12W處死動物,觀察該復(fù)合物對牙周組織再生的作用。 結(jié)果:1、酶消化法能夠成功獲得脂肪干細胞,經(jīng)CD44、CD29鑒定其間充質(zhì)干細胞來源; 2、培養(yǎng)液中所含血小板濃度為全血濃度的1.5倍時,PRP促進脂肪干細胞的增殖作用最佳; 3、在成骨細胞誘導(dǎo)液的誘導(dǎo)下,原代培養(yǎng)的脂肪干細胞能夠向成骨細胞轉(zhuǎn)化,形成鈣化結(jié)節(jié),PRP能夠有效的促進鈣化節(jié)結(jié)的形成. 4、細胞與支架材料復(fù)合培養(yǎng)7天后,細胞能夠與支架材料復(fù)合生長,附著緊密,伸展充分。 結(jié)論:1、脂肪干細胞取材方便,成活率高,增殖能力強,在礦化液誘導(dǎo)下,能向成骨細胞轉(zhuǎn)化,可以作為牙周組織工程良好的種子細胞; 2、PRP能夠促進脂肪干細胞的增殖,促進該細胞向成骨細胞分化,是牙周組織工程良好的細胞因子; 3、納米羥基磷灰石/膠原與脂肪干細胞的生物相容性良好,能夠作為牙周組織工程的支架材料; 4、脂肪干細胞-PRP-納米羥基磷灰石/膠原是促進牙周組織再生良好的組合。
【圖文】：

圖 1 體外分離培養(yǎng)犬脂肪干細胞。倒置顯微鏡下觀察。Fig 1 Explant and culture of ADSCs. Observation from inversion microscopeFig 1-1 passage 1 culture 24 hours 100×Fig 1-2 passage 1 culture 48 hours 200×Fig 1-3 passage 3 culture 24 hours 200×Fig 1-4 passage 4 culture 72 hours, bespread all the bottom of cell flask. 100×3.2 Beagle 犬脂肪干細胞的鑒定Beagle 犬 ADSCs 的 CD44，CD29 免疫組化染色分別見圖 2。由圖可見，CD44、CD29 的免疫組化染色均陽性，為細胞質(zhì)染色，每個切片隨機選擇 10 個視野，照相，利用捷達圖像分析軟件，約 80%細胞 CD44、 CD29 陽性.證明所培養(yǎng)的細胞，具有間充質(zhì)干細胞的特性。

圖 2 脂肪干細胞 CD44 CD29 免疫組化染色Fig 2 iummuochemical stain of ADSCs for CD44 CD29 Observation by optical microscope.Fig 2-1 CD44 iummuochemical stain 100×Fig 2-2 CD44 iummuochemical stain 200×Fig 2-3 CD29 iummuochemical stain 100×Fig 2-4 CD29 iummuochemical stain 200×3.3 PRP 的計數(shù)及瑞氏染色同一只 Beagle 犬相同體積的血液，相同方法進行 2 次 PRP 制備，制備前均用血球計數(shù)板計數(shù)，兩次計數(shù)結(jié)果分別為 289.1×109個/L 和 288.2×109個/L，平均為 288.65×109個/L。富血小板血漿制成后見圖 1-1，中間灰白色層即為血小板和白細胞層，兩次 PRP 制備后的血小板計數(shù)分別為 3501×109個/L 和 3504×109個/L，，平均值為 3502.5×109個/L，濃縮 12 倍，可見該方法能夠有效的濃縮血小板，
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R781.4

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本文編號：2661167