【摘要】：背景和目的口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC,oral squamous cell carcinoma)是口腔惡性腫瘤中發(fā)病率最高的類型,約占口腔惡性腫瘤的90%。即使醫(yī)學(xué)技術(shù)在不斷發(fā)展,OSCC患者的死亡率仍然處于較高的水平。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,其患病群體趨于年輕化,總體預(yù)后差,5年生存率低于50%。研究開發(fā)高效、低毒性的抗OSCC藥物具有非常重要的臨床意義。桑色素(Morin,3,5,7,2',4'-pentahydroxyflavone)是從�？浦参镏刑崛〉囊环N淺黃色黃酮類化合物。多種黃酮類化合物已在研究中被證實(shí),具有潛在藥用價值。Morin可以通過參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多條信號通路發(fā)揮其抗氧化、抗炎、抗菌及抗腫瘤等重要的生理作用。研究證實(shí),Morin作為具有生物活性的化合物,具有廣泛的藥理活性和極低的細(xì)胞毒性。探討Morin對OSCC細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用及分子機(jī)制,有助于為研究開發(fā)針對OSCC的抗腫瘤藥物提供理論基礎(chǔ)。Hippo通路是細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞多項生理活動的高度保守的信號通路。Hippo信號通路的激活,可以通過磷酸化YAP使其限定在胞質(zhì)內(nèi),使YAP被泛素化作用降解;Hippo信號通路失活,會導(dǎo)致YAP磷酸化水平降低和胞核富集,從而影響其下游多種靶基因的轉(zhuǎn)錄活性,對細(xì)胞的生物學(xué)行為起到調(diào)控作用。YAP蛋白作為轉(zhuǎn)錄共激活因子,參與調(diào)控與細(xì)胞增殖、凋亡、分化相關(guān)的生物信號,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。YAP蛋白水平的提高和胞核富集,可以誘導(dǎo)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Morin作為具有重要抗腫瘤活性的化合物,其對OSCC細(xì)胞調(diào)控作用的相關(guān)研究非常有限,且其在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮作用的分子機(jī)制也有待深入探討。因此,本研究旨在探討Morin對OSCC細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用,并探究Morin對OSCC所發(fā)揮的調(diào)節(jié)活性中,是否存在Hippo信號通路的介導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)首先檢測了正�？谇簧掀ぜ�(xì)胞和OSCC細(xì)胞對Morin敏感性的差異;其次,檢測了Morin在OSCC細(xì)胞多項生物學(xué)行為中的調(diào)控作用;并探討了 Hippo通路在Morin對OSCC細(xì)胞調(diào)節(jié)活性中的介導(dǎo)作用;以期為進(jìn)一步探究Morin在腫瘤治療方面的潛力和機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ),為開發(fā)、研究針對OSCC的治療藥物提供新的思路。材料和方法選擇口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Ca127和SCC15作為研究對象,探討Morin對OSCC細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用及其潛在機(jī)制。1.Morin對正�？谇簧掀ぜ�(xì)胞(HOEC)和OSCC細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用比較分別用Morin處理HOEC和OSCC細(xì)胞,以DMSO(二甲基亞砜)處理的細(xì)胞作為對照。用CCK-8法,檢測Morin對HOEC和OSCC的細(xì)胞毒性,并計算Morin在HOEC和OSCC細(xì)胞中的IC50;Western blot檢測Morin對HOEC和OSCC細(xì)胞ERK激活水平的影響。2.Morin對OSCC細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用(I)Morin分別處理Ca127、SCC15細(xì)胞,以DMSO處理作為對照:檢測Cal27、SCC15細(xì)胞的克隆形成能力、EdU著色能力。(2)Morin分別處理Ca127、SCC15細(xì)胞,以DMSO處理作為對照:流式細(xì)胞術(shù)檢測Ca127、SCC15的細(xì)胞周期分布和凋亡水平;Weestern blot檢測Ca127、SCC15細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子P53、P21,凋亡相關(guān)蛋白CASPASE-3、CASPASE-9、BCL-2 的表達(dá)水平。(3)Morin分別處理Ca127、SCC15細(xì)胞,以DMSO處理作為對照:劃痕實(shí)驗(yàn)檢測Ca127、SCC15的遷移能力;Western blot檢測Ca127、SCC15上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的標(biāo)志蛋白E-CADHERIN、VIMENTIN的表達(dá)水平。(4)裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn):生長狀態(tài)良好的裸鼠20只,隨機(jī)分為A、B兩組,每組10只,分別于裸鼠皮下注射Ca127、SCC15細(xì)胞構(gòu)建裸鼠體內(nèi)成瘤模型。A、B兩組裸鼠分別隨機(jī)分為A1、A2、B1、B2組,每組5只,連續(xù)25天:A1、B1組裸鼠經(jīng)尾靜脈注射50mg/kg Morin,每日1次;A2、B2組裸鼠經(jīng)尾靜脈注射與A1、B1組等劑量DMSO,每日1次。正常飼養(yǎng)25天后,處死裸鼠,剝離腫瘤,瘤體稱重、拍照。3.Hippo通路介導(dǎo)Morin對OSCC細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控作用的機(jī)制研究(1)Morin分別處理Ca127、SCC15細(xì)胞,以DMSO處理作為對照:①Western blot檢測通路中關(guān)鍵激酶MST1、MOB1蛋白表達(dá)水平和磷酸化水平,②Western blot檢測通路的關(guān)鍵效應(yīng)因子YAP蛋白的磷酸化水平,及其分別在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)水平,③免疫熒光染色檢測YAP蛋白胞質(zhì)胞核的亞細(xì)胞定位情況,④RT-PCR檢測通路下游靶基因Ctgf、Cyr61、Ankrd的mRNA表達(dá)水平。(2)構(gòu)建干擾和過表達(dá)Yap的Ca127、SCC15細(xì)胞,①EdU染色檢測細(xì)胞的增殖能力,②流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的周期分布和凋亡水平,③劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力。(3)構(gòu)建干擾MST1的Ca127、SCC15細(xì)胞,①Western blot檢測phospho-MST1、phospho-MOB1、phospho-YAP、cytoplasmic-YAP、nuclear-YAP的蛋白表達(dá)水平,②Morin處理感染病毒后的OSCC細(xì)胞,分為OSCC+DMSO組、OSCC+Morin組、LV3-ctrl-OSCC+Morin組、LV3-shMstl-OSCC+Morin組:EdU染色檢測細(xì)胞增殖能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的周期分布和凋亡水平;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力;Western blot檢測細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子P53、P21,凋亡相關(guān)蛋白CASPASE-3、CASPASE-9、BCL-2,上皮-間間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的標(biāo)志蛋白E-CADHERIN、VIMENTIN的表達(dá)水平。結(jié)果1.Morin對HOEC和OSCC的細(xì)胞毒性作用比較(1)與對照組相比,Morin對HOEC、Cal27、SCC15細(xì)胞均產(chǎn)生增殖抑制作用,該抑制作用存在Morin劑量依賴性,且Morin的半數(shù)抑制濃度在正�？谇簧掀ぜ�(xì)胞顯著高于OSCC細(xì)胞。(2)與對照組相比,Morin對HOEC、Ca127、SCC15細(xì)胞phospho-ERK表達(dá)均有抑制作用,對phospho-ERK起到顯著抑制作用的藥物濃度,在Ca127和SCC15細(xì)胞中顯著低于HOEC細(xì)胞。2.Morin對OSCC細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用(1)Morin處理Ca127、SCC15細(xì)胞,與對照組相比:OSCC細(xì)胞克隆形成能力、EdU著色陽性率顯著降低。(2)Morin處理Ca127、SCC15細(xì)胞,與對照組相比:OSCC細(xì)胞周期出現(xiàn)G1期阻滯,P53、P21的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào);細(xì)胞的凋亡水平增加,凋亡蛋白CASPASE-3、CASPASE-9的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào),抑凋亡蛋白BCL-2的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。(3)Morin處理Cal27、SCC15細(xì)胞,與對照組相比:OSCC細(xì)胞遷移能力顯著下降,黏附因子E-CADHERIN表達(dá)顯著上調(diào)、間質(zhì)表型的標(biāo)志蛋白VIMENTIN表達(dá)顯著下調(diào)。(4)裸鼠皮下移植OSCC細(xì)胞后,尾靜脈注射Morin組與尾靜脈注射DMSO組相比,OSCC細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成的瘤體平均重量顯著降低。3.Hippo通路介導(dǎo)Morin對OSCC細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控作用的機(jī)制研究(1)Morin處理Ca127、SCC15細(xì)胞,與對照組相比:MST1、MOB1總蛋白表達(dá)水平不變,MST1、MOB1、YAP蛋白磷酸化水平升高,cytoplasmic-YAP蛋白表達(dá)水平升高,nuclear-YAP蛋白表達(dá)水平下降;Ctgf、Cyr61、Ankrd的mRNA表達(dá)水平下調(diào)。(2)干擾YAP的Ca127、SCC15細(xì)胞,與對照組細(xì)胞相比:增殖能力下降,細(xì)胞周期發(fā)生阻滯,細(xì)胞凋亡水平上調(diào),細(xì)胞的遷移能力下降;過表達(dá)YAP的Cal27、SCC15細(xì)胞,與對照組細(xì)胞相比:增殖能力增強(qiáng),細(xì)胞周期加速,細(xì)胞凋亡水平下調(diào),細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)。(3)①干擾MST1的Cal27、SCC15細(xì)胞,與對照組細(xì)胞相比:MST1、MOB1、YAP的磷酸化水平降低,cytoplasmic-YAP蛋白水平降低,nuclear-YAP蛋白水平升高;②Morin處理感染病毒后的OSCC細(xì)胞,分為OSCC+DMSO組、OSCC+Morin 組、LV3-ctrl-OSCC+Morin 組、LV3-shMstl-OSCC+Morin 組:LV3-shMstl-OSCC+Morin組較OSCC+Morin組和LV3-ctrl-OSCC+Morin組,顯著逆轉(zhuǎn)了Morin處理OSCC細(xì)胞后EdU著色陽性率、細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡水平及細(xì)胞遷移能力的變化。③Morin處理感染病毒后的OSCC細(xì)胞,分為OSCC+DMSO 組、OSCC+Morin 組、LV3-ctrl-OSCC+Morin 組、LV3-shMstl-OSCC+Morin組:LV3-shMstl-OSCC+Morin組較OSCC+Morin組和LV3-ctrl-OSCC+Morin組,顯著逆轉(zhuǎn)了Morin處理OSCC細(xì)胞后相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)論1.Morin對HOEC、OSCC細(xì)胞均有細(xì)胞毒性作用,與正�？谇簧掀ぜ�(xì)胞相比,OSCC細(xì)胞對Morin敏感性更強(qiáng)。2.Morin對OSCC細(xì)胞生物學(xué)行為存在調(diào)控作用,具體表現(xiàn)為抑制OSCC細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷移,抑制細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力。3.Morin在OSCC細(xì)胞中上調(diào)Hippo信號通路的磷酸化水平,下調(diào)關(guān)鍵效應(yīng)因子YAP蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)水平。Hippo通路的關(guān)鍵效應(yīng)因子YAP對OSCC細(xì)胞的生物學(xué)行為的具有重要的調(diào)控作用。干擾MST1,抑制了Hippo通路磷酸化水平,顯著逆轉(zhuǎn)了Morin對OSCC細(xì)胞的調(diào)控作用,從而證實(shí)了Morin對OSCC細(xì)胞的調(diào)控活性中Hippo通路的重要介導(dǎo)作用。
【圖文】：

圖１－１．邋Ｍｏｒｉｎ對ＨＯＥＣ和ＯＳＣＣ細(xì)胞的毒性作用比較逡逑Ａ：邋Ｍｏｒｉｎ處理Ｃａｌ２７細(xì)胞４８ｈ、７２ｈ，細(xì)胞增殖能力ＣＣＫ－８檢測結(jié)果逡逑Ｂ：邋Ｍｏｒｉｎ處理ＳＣＣ１５細(xì)胞４８ｈ、７２ｈ，細(xì)胞增殖能力ＣＣＫ－８檢測結(jié)果逡逑Ｃ：邋Ｍｏｒｉｎ處理ＨＯＥＣ細(xì)胞４８邋ｈ、７２邋ｈ，細(xì)胞增殖能力ＣＣＫ－８檢測結(jié)果逡逑＊：邋ｐＣＯ．ＯＳｗＤＭＳＯ邋組逡逑

圖２－１．邋Ｍｏｒｉｎ對ＯＳＣＣ細(xì)胞克隆形成能力的影響逡逑Ａ：邋Ｍｏｒｉｎ處理兩周后，Ｃａｌ２７、ＳＣＣ１５細(xì)胞的克隆形成情況逡逑Ｂ：邋Ｍｏｒｉｎ處理兩周后，，Ｃａｌ２７、ＳＣＣ１５細(xì)胞克隆形成數(shù)目的量化分析逡逑ｊＤ＜０．０５ｗＤＭＳＯ邋組逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.8

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