發(fā)布時間：2020-05-13 01:37

【摘要】：背景和目的:健康的牙周狀況是正畸牙移動以及牙齒承受咬合力的保障,無論是正畸力還是生理范圍內(nèi)的咬合力,都會引起周期性的牙周組織改建,包括牙周膜改建和骨組織重塑等,這是一個非感染性、微創(chuàng)傷性的炎癥反應(yīng)過程。研究表明,機(jī)械力或一定程度的炎癥刺激,都會引起牙周局部微環(huán)境的變化,如血流的變化以及各種炎癥因子的表達(dá)變化,從而引起牙周組織的改建。超出生理范圍的正畸力或者咬合力都可能引起牙周組織一過性甚至不可逆性的損害,對于牙周炎易感患者而言,這個生理范圍卻相對縮小了,其牙周局部微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)更容易被破壞。牙周膜對正畸力或咬合力的吸收和分散是維持牙周穩(wěn)態(tài)所必須的,研究證實(shí),骨膜蛋白(Periostin,POSTN)在這個過程中扮演了非常重要的角色。骨膜蛋白因其特異性分布在骨膜和牙周膜而被命名,近年來研究發(fā)現(xiàn)骨膜蛋白在骨骼肌、心肌、肺、肌腱等富含纖維組織的器官中同樣表達(dá)且起著非常重要的作用,尤其是在持續(xù)接受機(jī)械應(yīng)力刺激的組織中。作為一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,骨膜蛋白在發(fā)育個體中的表達(dá)更優(yōu)于成熟個體,但在血管損傷和骨折時表達(dá)增加;在維持牙周膜的完整性方面,骨膜蛋白也起著非常重要的作用。研究指出,正畸牙移動的初始階段,骨膜蛋白在牙周膜中的表達(dá)顯著增加。在牙周組織中,骨膜蛋白主要表達(dá)在成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及骨細(xì)胞,它參與了細(xì)胞外膠原纖維的合成,同時又可以通過與細(xì)胞表面αvβ3整合素受體結(jié)合,參與牙周組織及骨組織對機(jī)械應(yīng)力的感受,促進(jìn)很多細(xì)胞的遷移及粘附能力。眾多研究表明骨膜蛋白在牙周組織改建過程中起著舉足輕重的作用:敲除骨膜蛋白后,正畸牙齒移動速率降低,組織學(xué)觀察牙齒的壓力側(cè)及張力側(cè)正常的骨硬化素(Sclerostin,SOST)表達(dá)變化及膠原生成降解消失,同時骨膜蛋白敲除的小鼠牙周組織缺陷,生理范圍內(nèi)的咬合力及正畸力都極易造成牙槽骨及其他牙周組織的缺損。牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cell,PDLSCs)是牙周膜中存在的少量間充質(zhì)干細(xì)胞,具有多向分化潛力及牙周再生能力,在牙周改建、牙周組織再生中具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn),骨膜蛋白可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)的遷移、歸巢及成骨分化,但骨膜蛋白對PDLSCs的影響還未見報(bào)道。根據(jù)以上發(fā)現(xiàn),我們提出假設(shè)骨膜蛋白可以通過影響PDLSCs的生物學(xué)行為從而參與牙周組織改建,故我們擬通過本研究探討POSTN對PDLSCs增殖、遷移、粘附以及成骨向分化的影響,從而深入了解骨膜蛋白參與牙周改建的機(jī)制。方法:臨床上收集納入標(biāo)準(zhǔn)的離體牙(25歲以下牙根完整的正畸拔除牙齒或者健康的阻生智齒),去除多余上皮組織和炎癥肉芽組織,含5%雙抗的PBS緩沖液及組織培養(yǎng)基交替沖洗牙周膜組織,修剪根中1/3的牙周膜組織為1mm3大小,并用鑷子挑取,均勻置于培養(yǎng)瓶底;利用組織塊法體外分離培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞,并利用高濃度血清培養(yǎng)基提高分離成功率和細(xì)胞存活能力。常規(guī)培養(yǎng)1-2周后,倒置顯微鏡下可觀察到有細(xì)胞逐漸從組織邊緣游離,細(xì)胞貼壁長滿瓶底即可傳代培養(yǎng)。選取P2和P3代牙周膜細(xì)胞分別進(jìn)行單克隆篩選及干性鑒定,并選取P4或P5代牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn):通過給予不同濃度的人重組骨膜蛋白(recombinant human periostin,rhPOSTN),分別利用 CCK8、Transwell、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測骨膜蛋白對牙周膜干細(xì)胞增殖、遷移及粘附能力的影響。通過對牙周膜干細(xì)胞的成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng),研究骨膜蛋白對牙周膜干細(xì)胞成骨分化過程中ALP活性及礦化沉積能力的影響,同時利用qRT-PCR檢測了成骨誘導(dǎo)7d后牙周膜干細(xì)胞中Runx2、ALP、OPN、OCN、osterix及BSP的表達(dá)變化,初步探究骨膜蛋白對牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)行為影響的作用機(jī)制。結(jié)果:(1)牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及干性鑒定:牙周膜原代細(xì)胞在7d左右從組織塊游出,2-4w爬滿培養(yǎng)瓶,以組織塊為中心呈放射狀、旋渦狀生長,傳代后細(xì)胞生長旺盛、狀態(tài)良好、性狀穩(wěn)定,具有一定單克隆能力,流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面分子,驗(yàn)證了其間充質(zhì)來源;細(xì)胞體外成骨成脂誘導(dǎo)后,出現(xiàn)明顯礦化結(jié)節(jié)和脂滴。(2)CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對照組相比,在24h、48h、72h三個時間點(diǎn)檢測,較低濃度如20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的rhPOSTN可以促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的增殖,且隨濃度的增加而增加,但高濃度的rhPOSTN可以抑制hPDLSCs的增殖。(3)Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、粘附實(shí)驗(yàn):Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)證明,與對照組相比,50ng/ml和100ng/ml的rhPOSTN能明顯提高h(yuǎn)PDLSCs的遷移能力。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,骨膜蛋白可明顯促進(jìn)細(xì)胞的初期黏附與伸展。(4)堿性磷酸酶定量檢測、茜素紅染色實(shí)驗(yàn)和qRT-PCR結(jié)果顯示:體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后,骨膜蛋白可促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞內(nèi)及上清中ALP活性的表達(dá),同時提高細(xì)胞的礦化沉積能力,qRT-PCR結(jié)果顯示骨膜蛋白不同程度的提高了牙周膜干細(xì)胞中ALP、osterix、Runx2、OPN、OCN及BSP等成骨相關(guān)因子的表達(dá)。結(jié)論:(1)一定濃度的骨膜蛋白可以促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的增殖,但是高濃度的骨膜蛋白反而抑制牙周膜干細(xì)胞的增殖。(2)在適宜濃度范圍內(nèi),骨膜蛋白可以刺激牙周膜干細(xì)胞的遷移和粘附,且這種促進(jìn)作用呈現(xiàn)濃度梯度。(3)在適宜濃度范圍內(nèi),骨膜蛋白可以促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的成骨向分化,促進(jìn)ALP活性的表達(dá)、礦化沉積能力以及各成骨相關(guān)因子的表達(dá)。
【圖文】：

山東大學(xué)碩士學(xué)位論文逡逑分布均勻，約３－５ｄ即可達(dá)到９０％以上細(xì)胞融合。逡逑圖１．１人牙周膜干細(xì)胞（ｈＰＤＬＳＣｓ）原代培養(yǎng)0４０）及Ｐ１代細(xì)胞（ｘｌＯＯ）逡逑３．２有限稀釋法篩選及單克隆形成率：逡逑挑選９６孔板中形成較大克隆的細(xì)胞，消化分離即為篩選出的牙周膜干逡逑細(xì)胞，將Ｐ３代牙周膜千細(xì)胞按照８００個細(xì)胞／皿接種至大皿，培養(yǎng)１０ｄ后，逡逑鏡下可見較多的單克隆集落形成，細(xì)胞呈長梭形，體積較小，排列緊湊，克逡逑隆狀生長，固定染色后，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)大于５０個的細(xì)胞克隆，，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三遍，逡逑取平均數(shù)求得單克隆形成率：逡逑單克隆形成率＝單克隆形成數(shù)／細(xì)胞接種數(shù)ｘｌＯＯ％逡逑＝１３．３７５％逡逑Ａ邋？逡逑？＞－、、、．邋一逡逑、邐１邋ｍｍ逡逑圖１．２單皿法檢測單克隆形成大體觀及單克隆細(xì)胞簇（４０）逡逑３．３流式鑒定不同表面分子的表達(dá)：逡逑經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測ｈＰＤＬＳＣｓ表面分子，結(jié)果顯示ＣＤ３４陰性（０．１０％）、逡逑ＣＤ４５邋陰性（０．０５２％）、ＣＤ４４邋陽性（１００％）、ＣＤ９０邋陽性（１００％）、ＣＤ１０５逡逑陽性（９９．６％），說明本實(shí)驗(yàn)中得到的ｈＰＤＬＳＣｓ為間充質(zhì)來源，具有干細(xì)胞逡逑１９逡逑

、邐１邋ｍｍ逡逑圖１．２單皿法檢測單克隆形成大體觀及單克隆細(xì)胞簇（４０）逡逑３．３流式鑒定不同表面分子的表達(dá)：逡逑經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測ｈＰＤＬＳＣｓ表面分子，結(jié)果顯示ＣＤ３４陰性（０．１０％）、逡逑ＣＤ４５邋陰性（０．０５２％）、ＣＤ４４邋陽性（１００％）、ＣＤ９０邋陽性（１００％）、ＣＤ１０５逡逑陽性（９９．６％），說明本實(shí)驗(yàn)中得到的ｈＰＤＬＳＣｓ為間充質(zhì)來源，具有干細(xì)胞逡逑１９逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R783.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 蔣俊強(qiáng);王忠朝;黎春暉;蔡煒;;三種方法原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年23期

2 李雋;胥春;郝軼;張富強(qiáng);;人牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年11期

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1 張瑛;牙周膜干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定[D];南昌大學(xué);2011年

本文編號：2661162