【摘要】： 目的：觀察三種不同fimA基因型P.gingivalis-LPS對HUVEC產(chǎn)生致炎細胞因子、趨化因子以及黏附分子的影響,初步探討P.gingivalis感染在AS發(fā)生和發(fā)展的可能作用以及作為牙周炎與AS相關的物質基礎的可能。 方法：厭氧培養(yǎng)ⅠfimA型(ATCC 33277)、ⅡfimA型(WCSP115)、ⅣfimA型(W83)P.gingivalis,采用熱酚-水法提取P.gingivalis-LPS,應用SDS-PAGE+銀染、紅外線光譜分析、鱟試驗對提取的脂多糖予以鑒定；體外培養(yǎng)HUVEC,待HUVEC單層融合后,分別加入不同終濃度的P.gingivalis-LPS,共同培養(yǎng)2h、6h、24h,應用ELISA法測定培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8和MCP-1的分泌量；提取HUVEC總RNA, RT-PCR法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達水平,FCM技術檢測HUVEC表面ICAM-1和VCAM-1蛋白表達量。 結果：(1)本實驗研究條件下所提取的P.gingivalis細菌物質經(jīng)紅外光譜分析和SDS-PAGE電泳分析,表明其結構與Ecoli-LPS相似,系P.gingivalis-LPS,鱟試驗表明所提取的P.gingivalis-LPS具有較高的生物學活性(≥15ng/ml),可用于后續(xù)的實驗。 (2)3型P.gingivalis-LPS作用于HUVEC后,細胞表達IL-1β蛋白水平及mRNA水平升高,在較高濃度(5、10μg/ml)時,Ⅱ型fimA P.gingivalis-LPS刺激HUVEC IL-1β蛋白水平及mRNA的表達強于Ⅰ型fimA P.gingivalis-LPS。 在3型P.gingivalis-LPS刺激下,HUVEC IL-6水平的升高發(fā)生在轉錄mRNA水平和轉錄后蛋白水平,且存在著濃度依賴效應；不同fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激作用存在著差異。在蛋白水平上,Ⅱ型和Ⅳ型fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激作用強于Ⅰ型fimA基因型P.gingivalis-LPS,但上調(diào)作用出現(xiàn)較晚。在mRNA水平上,Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激HUVEC表達IL-6 mRNA的作用較強。 在3型P.gingivalis-LPS刺激下,HUVEC TNF-α蛋白水平及mRNA的表達量上調(diào),且存在著濃度依賴效應,蛋白水平在24h時表達量達到高峰。在一些濃度下,Ⅱ型fimAP.gingivalis-LPS刺激HUVEC TNF-α蛋白水平比Ⅳ型fimA P.gingivalis-LPS的作用強。在mRNA水平上,高濃度(5、10μg/ml)時,Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS具有較強的刺激HUVEC表達TNF-αmRNA的作用。 提示3型P.gingivalis-LPS對HUVEC表達IL-1β、IL-6和TNF-α的調(diào)節(jié)發(fā)生在轉錄和轉錄后兩個水平,從而導致血管內(nèi)皮細胞功能紊亂,可能在AS的進程中起到關鍵的作用,且fimA基因型的差異可能導致Rgingivalis-LPS在調(diào)控HUVEC產(chǎn)生致炎細胞因子的能力存在差異。 (3)本實驗研究條件下,應用3型P.gingivalis-LPS刺激HUVEC后細胞表達IL-8蛋白水平和mRNA的水平升高,且存在著濃度依賴效應。mRNA水平6h時達到高峰,蛋白水平24h時分泌量達到高峰。3型P.gingivalis-LPS間刺激HUVEC表達IL-8蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)。6h時,5μg/ml濃度Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS較強刺激HUVEC表達IL-8mRNA的作用(p0.05)。 在3型P.gingivalis-LPS刺激下,HUVEC MCP-1的升高發(fā)生在轉錄mRNA水平和轉錄后蛋白水平,且存在著濃度依賴效應,mRNA水平在6h時達到高峰,24h時恢復到正常水平；蛋白水平在24h時達到高峰。Ⅰ型fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激HUVEC MCP-1的蛋白表達強于Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS。 提示P.gingivalis-LPS誘導HUVEC產(chǎn)生趨化因子的作用可能在AS進程中發(fā)揮作用。fimA基因型的差異可能導致P.gingivalis-LPS誘導HUVEC表達MCP.1的能力存在著差異。 (4)本實驗研究條件下,P.gingivalis-LPS刺激HUVEC后表達VCAM-1 mRNA與陰性對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(p0.05)；在6h時,較高濃度的(5、10μg/ml)Ⅰ型和Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激HUVEC表達ICAM-1 mRNA表達增加,Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS這種上調(diào)作用強于Ⅰ型和Ⅳ型fimA P.gingivalis-LPS;但在蛋白水平上,本實驗條件下未能檢測到VCAM-1和ICAM-1蛋白水平的升高。 提示較高濃度下,P.gingivalis-LPS可刺激HUVEC表達ICAM-1mRNA的水平上調(diào),P.gingivalis-LPS對HUVEC產(chǎn)生VCAM-1mRNA的作用不明顯。 結論：3型P.gingivalis-LPS均能刺激HUVEC表達致炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α,趨化因子IL-8和MCP-1,而且使黏附分子ICAM-1mRNA轉錄水平升高。不同fimA基因型P.gingivalis-LPS對HUVEC功能的影響存在著差異。提示P.gingivalis感染可引起內(nèi)皮細胞活化和功能紊亂,從而引發(fā)內(nèi)皮細胞的炎癥反應,可能在AS的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵作用。
【圖文】：

3.4賞試驗結果:表1一1不同刀邢A基因型尸g功givalis一LPS及E.coll一LPS邀試驗結果分組(Lps濃度n創(chuàng)ml)100502520151052I型盧川月p羅n羅valis-LPs++十++一一一一n型刀腳月尸gin鄉(xiāng)va沁一LPS+++++一一一一W型萬用月p夢呼valis一LPs+++++一一一一E.coli一LPS+++++一一一一陰性對照為等量的無熱源性水，結果均為陰性討論LPS是革蘭陰性厭氧菌細胞壁的主要成分，是重要的毒力因子。LPS被認為pgingivall’s眾多致病因子中最重要的毒力因子之一[23l。研究表明pgingivalis一LP

10協(xié)ISYBR⑧尸爬m(xù)撫ExTa護M(內(nèi)含兀話故尺aExTa叮⑧HS，dNTpMixture，M擴+，SYoreenl等)、l林l一o娜oFL上游引物、l川10卿01幾下游引物、2林1cDNA模板、ddHZO。反應條件為95℃預變性305，，40個循環(huán)(95℃變性5s、退火溫度見相應的退火溫度305、延伸75℃305)。將PCR儀的熒光采集時間統(tǒng)一設定在擴增反延伸期。40個循環(huán)的擴增結束后，系統(tǒng)將采集每一循環(huán)反應時的各反應管的熒度增長指數(shù)進行分析并繪制每一反應管的擴增動力曲線。根據(jù)擴增動力曲線確定樣本品管中熒光強度增加到某一特定閩值是的擴增循環(huán)數(shù)(CT值)，根據(jù)CT值準模板初始拷貝的對數(shù)值作圖，得到該樣本的待測基因的標準曲線。(9)作用后HUvEC中IL一lp、IL一6、TNF一a目的基因相對拷貝數(shù)的測定:將逆轉錄得到的樣本的cDNA取2川，加入上述反應體系，相同的反應條件行PCR擴增。收集數(shù)據(jù)，繪制動力學曲線，測定各樣品的CT值與標準線進行比與內(nèi)參基因的CT值加以校正。下下I一
【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R781.4

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 崔平平;牙齦卟啉單胞菌上清液對人臍靜脈內(nèi)皮細胞分泌炎性因子的影響[D];昆明醫(yī)學院;2011年

本文編號：2660908