【摘要】：牙周病是牙齒支持組織，包括牙周膜、牙槽骨、牙骨質(zhì)在內(nèi)的炎癥性疾病，若未得到及時治療可導致牙槽骨的吸收致使牙齒脫落，它是嚴重危害人類牙齒和全身健康的常見口腔疾病。牙周病學的研究已成為口腔界的主要研究領(lǐng)域，并在此領(lǐng)域的研究中取得了長足的進步。但由于目前常規(guī)牙周治療方法的局限性，尚不能再生出完整的牙周組織，而組織再生技術(shù)彌補了牙周組織再生過程中的某些不足，已開始應用于牙周再生領(lǐng)域。 移植干細胞對組織的修復和重建能力取決于種子細胞自身的生物學特性以及宿主微環(huán)境的直接和間接的作用。目前對于組織工程中干細胞和微環(huán)境誰的主導作用更為明顯尚存在爭議。但總體概念是干細胞和微環(huán)境相互影響，，共同介導了種子細胞的遷移、定植、分化和增殖過程。宿主植床內(nèi)時空分布的各種信號分子介導了干細胞的分化和增殖；同時種子細胞通過旁分泌作用改善宿主微環(huán)境，甚至調(diào)控機體全身狀況達到組織再生和修復的目的。因此，選擇合適的種子細胞類型不僅關(guān)系到種子細胞本身的生物學活性，也影響著宿主微環(huán)境；而改善宿主微環(huán)境則更利于移植干細胞的存活、分化和活性的發(fā)揮。 牙周膜干細胞（PDLSC）和骨髓基質(zhì)干細胞(BMMSC)是具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細胞，但其再生能力受移植模式、誘導環(huán)境、宿主微環(huán)境調(diào)控等條件的影響。兩種干細胞的所表現(xiàn)出的牙周再生能力尚不一致，近年來兩種不同的干細胞在基礎研究領(lǐng)域及臨床組織器官修復領(lǐng)域廣泛應用。因而，能否利用兩種干細胞不同分化的特性在牙周組織工程中協(xié)同作用，再生出牙槽骨、牙周膜/牙骨質(zhì)樣組織，為應用干細胞治療的內(nèi)源性再生醫(yī)學技術(shù)作為轉(zhuǎn)化為臨床治療手段提供依據(jù)。 為此本課題設計為以下三個部分： 第一部分骨髓基質(zhì)干細胞與人牙周膜干細胞膜片的制備與鑒定 目的：通過有限稀釋法成功分離培養(yǎng)人牙周膜干細胞與骨髓基質(zhì)干細胞，并制備成單層細胞膜片與牙本質(zhì)片和HA-TCP共培養(yǎng)，檢測干細胞和細胞膜片的生物學活性。方法：通過流式細胞儀檢測牙周膜干細胞與骨髓基質(zhì)干細胞的細胞表型和細胞周期；對兩種干細胞進行成骨和成脂誘導；MTT和克隆形成率檢測評價其增殖能力；組織學和免疫組織化學觀察單層細胞膜片的結(jié)構(gòu)；將兩種膜片與牙本質(zhì)片和HA-TCP共培養(yǎng)電鏡觀察支架材料對膜片結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果：1、兩種干細胞具有集落化生長的趨勢；2、兩種干細胞成骨成脂誘導后茜素紅染色和油紅O染色陽性；3、制備的單層hPDLSC膜片和BMMSC膜片內(nèi)大量細胞外基質(zhì)沉積、細胞排列更為緊密、極性化更為明顯，均強陽性表達Col-I，OCN、Lamin等細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白，弱表達Col-Ⅲ；4、膜片與支架材料共培養(yǎng)電鏡結(jié)果顯示膜片內(nèi)細胞形態(tài)未見顯著性變化，細胞復層化趨勢更為明顯，層間細胞間有序地連接，細胞的極性化趨勢更為明顯，BMMSC組可見空間分布更為廣泛和致密的細胞外礦化基質(zhì)的沉積。結(jié)論：本組分離培養(yǎng)的PDLSC和BMMSC具有間充質(zhì)干細胞特性。以其為種子細胞的膜片具有豐富的細胞外基質(zhì)，能夠介導細胞與支架材料的吸附和定植。 第二部分兩種干細胞膜片復合不同支架材料體內(nèi)異位再生的實驗研究 目的：通過將hPDLSC膜片與hBMMSC膜片復合后與牙本質(zhì)片和HA-TCP共培養(yǎng)，并進行體內(nèi)不同部位移植以評價體內(nèi)及體外微環(huán)境對干細胞分化的影響。方法：通過兩類單層膜片復合后與牙本質(zhì)片和HA-TCP共培養(yǎng)，電鏡和組織學動態(tài)觀察膜片顯微結(jié)構(gòu)變化，并將hPDLSC cs、hBMMSC cs和hPDLSC/BMMSC cs進行皮下和顱骨缺損移植比較組織再生情況。結(jié)果：1、雙層細胞膜片的質(zhì)地更為致密，細胞結(jié)合緊密，表面大量礦化沉積，細胞與牙本質(zhì)的骨架結(jié)合緊密；2、三種膜片無支架材料皮下移植均僅有質(zhì)地、走形不一致的纖維組織的再生，未見礦化物質(zhì)的生成；3、三種膜片復合牙本質(zhì)片皮下移植均可形成不均量的礦化物沉積和纖維樣組織，似牙周膜/牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，PDLSC組和PDLSC/BMMSC組再生的纖維穿通性更明顯，表面礦化沉積更均衡；4、三種膜片復合HA-TCP皮下也形成類牙周膜/牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，但纖維和礦化物的沉積均差于相應的牙本質(zhì)片組，以BMMSC組最差；5、顱骨缺損修復組織學結(jié)果顯示植入?yún)^(qū)無明顯炎癥反應，炎細胞較少，缺損邊緣可見大量的新生骨組織形成。結(jié)論： hPDLSC/BMMSC復合膜片能夠整合兩種干細胞的生物學特性，在適宜的微環(huán)境作用下更有利于干細胞向牙周再生方向定向分化。 第三部分犬PDLSC/BMMSC膜片在牙周組織缺損修復再生中的實驗研究 目的：觀察犬PDLSC cs、BMMSC cs和PDLSC/BMMSC cs對犬急性牙周缺損的再生作用。方法：分離培養(yǎng)犬PDLSC和BMMSC，并制備PDLSC cs、BMMSC cs和PDLSC/BMMSC cs；建立急性牙周缺損模型，進行膜片移植，組織學及影像學評價。結(jié)果：1、PDLSC和BMMSC兩種干細胞都具有間充質(zhì)干細胞特性；2、犬PDLSC cs和BMMSC cs的成膜速度均快于人的兩種干細胞膜片；3、對PDLSC膜片、BMMSC膜片和PDLSC/BMMSC復層膜片術(shù)前術(shù)后的影像學結(jié)果比較顯示：三組均有較強的骨組織再生修復能力，牙槽骨缺損均達到完全修復，術(shù)前術(shù)后牙槽骨密度、鄰間牙槽嵴高度、附著喪失未見顯著差異。對照組骨密度有一定程度增加，牙槽骨增加不明顯。4、組織學觀察顯示：PDLSCs，BMMSCs及PDLSCs/BMMSCs組牙周缺損部分均有不同程度的修復和再生，而空白對照組增生不明顯。結(jié)論：PDLSC cs、BMMSC cs對牙周組織再生均起著重要的作用。PDLSC/BMMSC cs能夠利用兩種干細胞分化特性，在牙槽骨、牙根面等復雜的牙周微環(huán)境作用下再生出牙槽骨、牙周膜/牙骨質(zhì)樣組織。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R781.4

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 唐亮;金巖;;影響牙周膜干細胞功能的重要因素[J];實用口腔醫(yī)學雜志;2009年05期

2 張紅珊;方建培;蘇浩彬;楊e

本文編號：2652323