miR-467f對(duì)高糖環(huán)境下小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的調(diào)節(jié)機(jī)制研究

發(fā)布時(shí)間：2020-05-07 00:56

【摘要】：目的：人工種植技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用到牙齒缺失、頜骨缺損等多個(gè)方面，成為一種成熟可靠的修復(fù)方法。隨著種植技術(shù)的不斷發(fā)展，因口腔缺牙接受種植的糖尿病患者越來越多，但其種植的高失敗率一直困擾著口腔臨床醫(yī)生，前期研究已證實(shí)種植體周圍不能形成良好的骨性結(jié)合是其失敗的主要原因，但其確切的作用機(jī)制尚不清楚。糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。研究已證實(shí)，糖尿病會(huì)導(dǎo)致人或者動(dòng)物模型的骨組織鈣磷流失，骨代謝異常，以及骨結(jié)構(gòu)和骨質(zhì)量發(fā)生改變�；颊哳M骨往往因糖尿病影響表現(xiàn)出相關(guān)變化，如牙槽骨的喪失及頜骨的骨質(zhì)改變。頜骨的質(zhì)量是人工種植體修復(fù)成功的基礎(chǔ)，糖尿病對(duì)頜骨的影響無疑會(huì)影響到種植的成功率。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs）具有多向分化潛能以及自我更行能力，這些功能特性使得它成為骨再生修復(fù)的重要種子細(xì)胞。成骨發(fā)生的關(guān)鍵是骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向骨形成轉(zhuǎn)變，分化為成骨細(xì)胞，但這是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，要受到到多種信號(hào)通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等組成的復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。BMP信號(hào)通路是其中最主要的信號(hào)通路之一，而該通路中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是促進(jìn)骨形成和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化最重要的細(xì)胞外信號(hào)分子之一。microRNA（miRNA）是動(dòng)植物細(xì)胞中一類長度為22-25nt具有調(diào)控基因功能的小分子非編碼RNA，近年來大量文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA也參與調(diào)控了成骨細(xì)胞的成骨分化過程。目前研究已經(jīng)證實(shí)，高糖環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力減弱，成骨細(xì)胞的增殖和礦化能力也減弱，這些都被認(rèn)為是糖尿病導(dǎo)致骨質(zhì)下降的原因，但其機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)將研究高糖環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)行為，明確高糖環(huán)境對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞骨向分化能力的影響及其BMP信號(hào)通路在其中發(fā)揮的作用，并且從miRNA的角度出發(fā)，篩選和驗(yàn)證高糖環(huán)境下差異表達(dá)的miRNA，研究高糖環(huán)境下miRNA和BMP-2在骨髓干細(xì)胞成骨分化過程中的調(diào)控機(jī)制，從而探討高糖環(huán)境影響干細(xì)胞成骨能力的分子調(diào)節(jié)機(jī)制，為糖尿病引起的骨代謝異常提供理論依據(jù)。方法：第一部分:從雄性C57小鼠下頜骨獲取原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，體外傳代培養(yǎng)觀察其生長特性。采用流式細(xì)胞儀技術(shù)對(duì)純化的第四代細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物的檢測(cè)。并進(jìn)行體外成脂以及成骨定向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能。第二部分：模擬高糖環(huán)境，在四種不同的糖濃度下培養(yǎng)BMSCs，比較在正常糖濃度以及高糖環(huán)境中培養(yǎng)的BMSCs的生物學(xué)功能，我們用MTT法以及流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞活性、細(xì)胞周期以及凋亡的檢測(cè)，并且通過茜素紅染色，ALP活性以及細(xì)胞分泌鈣、磷量檢測(cè)不同糖濃度下BMSCs的成骨能力。第三部分：探討高糖環(huán)境作用下BMP信號(hào)通路在BMSCs成骨分化過程中的調(diào)控作用,根據(jù)前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以25mM的糖濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的高糖濃度，我們用Real-time RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞成骨基因RUNX2、 ALP和OCN的表達(dá)情況進(jìn)一步驗(yàn)證高糖對(duì)成骨的抑制作用。并在不同糖濃度成骨誘導(dǎo)下用Western Blot檢測(cè)全細(xì)胞蛋白BMP-2的表達(dá)水平。之后通過加入外源性BMP-2干預(yù)后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)BMP-2的表達(dá)水平以及成骨基因RUNX2、 ALP和OCN的表達(dá)水平。第四部分：用Agilent小鼠miRNA（8*60K）芯片篩選高糖環(huán)境培養(yǎng)下差異表達(dá)的miRNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)結(jié)果加以驗(yàn)證,選出其中高表達(dá)的并且其靶基因可能是BMP-2的miRNA。第五部分：利用Real-time PCR檢測(cè)在BMSCs成骨分化過程中miR-467f的表達(dá)譜。細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-467f雙鏈RNA mimics，利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成骨標(biāo)志性基因，利用茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞體外礦化能力，，驗(yàn)證miR467f對(duì)BMSCs成骨分化的影響。利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證BMP-2是否為miR-467f可能作用的靶基因。將miR-467f和siBMP-2雙鏈mimics分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞并誘導(dǎo)其成骨分化，比較兩組成骨分化表型，探討miR-467f抑制BMSCs的成骨分化調(diào)控機(jī)制。結(jié)果： 1.分離培養(yǎng)的頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞表面分子陽性，造血和上皮細(xì)胞表面分子陰性，符合干細(xì)胞CD分子表型。能成功的進(jìn)行了成骨、成脂定向誘導(dǎo)分化，符合干細(xì)胞的功能特異性。 2.25mM的糖濃度，具有明顯的促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。但是糖濃度過高達(dá)到35mM時(shí)，會(huì)抑制增殖殖促進(jìn)凋亡。成骨誘導(dǎo)后，隨著糖濃度的增加，礦化結(jié)節(jié)的形成量、ALP活性以及鈣磷分泌量都大大降低，BMSCs的成骨分化能力降低。 3.25mM的糖濃度下進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，細(xì)胞成骨基因RUNX2、 ALP和OCN表達(dá)水平降低，BMP-2蛋白的表達(dá)水平降低。加入外源性BMP-2上調(diào)BMP信號(hào)通路后細(xì)胞內(nèi)BMP-2蛋白的表達(dá)水平以及成骨基因RUNX2、 ALP和OCN的表達(dá)水平都有了顯著提高，可見干細(xì)胞的成骨能力增強(qiáng)。 4.通過microRNA芯片篩選以及實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，在高糖環(huán)境培養(yǎng)下共有16個(gè)下調(diào)，11個(gè)上調(diào)的差異表達(dá)miRNA。在上調(diào)的miRNA中， miR-467f、miR-2183、miR-3472和miR-345-5p可能與成骨有關(guān)且其靶基因可能是BMP-2。 5.在誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的過程中，用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)前面實(shí)驗(yàn)中選擇的四個(gè)miRAN，結(jié)果顯示miR-467f在成骨過程中持續(xù)表達(dá)，并且隨時(shí)間逐漸降低。細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-467f雙鏈mimics后培養(yǎng)后成骨誘導(dǎo)， RUNX2、ALP和OCN的mRNA表達(dá)降低,體外礦化能力下降。BMP-2是miR-467f的作用的靶基因之一。過表達(dá)miR-467f可以顯著抑制BMP-2基因和蛋白的表達(dá)以及RUNX2、ALP和OCN的mRNA表達(dá)，該抑制作用和siBMP-2雙鏈mimics對(duì)成骨分化的抑制作用相似。結(jié)論： 1.高糖環(huán)境影響了小鼠頜骨骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，導(dǎo)致其增殖能力增強(qiáng)而成骨分化能力減弱。 2.在高糖環(huán)境培養(yǎng)下，存在差異表達(dá)的miRNA，其中高表達(dá)的miR-467f在BMSCs成骨分化過程中表達(dá)降低，而且過表達(dá)miR-467f可以減弱干細(xì)胞的成骨分化能力。 3. miR-467f抑制小鼠頜骨BMSCs成骨分化是通過調(diào)控其特異的靶基因BMP-2發(fā)揮作用。 4.高糖環(huán)境下miR-467f上調(diào)，引起B(yǎng)MP-2表達(dá)抑制，可能是高糖抑制BMSCs成骨能力減弱的原因之一。
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