發(fā)布時間：2020-05-03 20:44

【摘要】：研究目的:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)可以趨化至多種類型的腫瘤微環(huán)境,被認(rèn)為具有靶向載藥的潛能,但BMSCs對口腔鱗癌是否具有趨化作用,以及BMSCs對口腔鱗癌趨化的機(jī)制并不清楚,因此本研究將探究BMSCs對口腔鱗癌的趨化作用及其內(nèi)在的機(jī)理機(jī)制。研究方法:1、將復(fù)蘇后的BMSCs用流式抗體標(biāo)記,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測其表面受體,確定BMSCs的純度。2、免疫組織熒光染色檢測BMSCs在口腔鱗癌組織內(nèi)的分布浸潤情況。收集不同細(xì)胞的上清液作為條件培養(yǎng)基(conditional media,CM),trans-well共培養(yǎng)體系檢測不同CM對BMSCs的趨化作用。Real-Time PCR方法檢測相關(guān)細(xì)胞趨化因子(CCL2、CCL3、CCL5、CXCL1、CXCL8、CXCL16)和趨化因子受體(CXCR1、CXCR2)的表達(dá);ELISA檢測CXCL8趨化因子的分泌情況;加入抑制劑后檢測BMSCs的趨化作用。3、對新型納米材料金納米簇(AuNC)進(jìn)行物理、化學(xué)及生物安全性檢測后,AuNC體外標(biāo)記BMSCs,利用Ca127建立裸鼠移植瘤模型,尾靜脈注射標(biāo)記后的BMSCs,小動物活體成像、冰凍切片分別從不同層次觀察BMSCs的趨化情況。研究結(jié)果:1、復(fù)蘇后的BMSCs傳代培養(yǎng)至第二代,形態(tài)穩(wěn)定,倒置顯微鏡觀察可見:BMSCs呈長梭形,胞質(zhì)豐富,細(xì)胞核呈橢圓形或腎形,細(xì)胞突向兩側(cè)伸展,細(xì)胞排列密集呈放射狀。流式細(xì)胞術(shù)檢測BMSCs的細(xì)胞表型結(jié)果顯示:BMSCs特異性抗原CD90、CD105和CD44高表達(dá),造血系抗原CD45和CD11b低表達(dá)。2、在口腔鱗癌組織內(nèi)分布著大量的BMSCs,體外Trans-well實驗顯示與正常上皮細(xì)胞Hacat相比,Ca127和FaDu可明顯趨化BMSCs。Real-time PCR顯示在CCL2、CCL3、CCL5、CXCL1、CXCL8、CXCL16這些常見的趨化因子中CXCL8的mRNA表達(dá)量明顯升高,ELISA檢測細(xì)胞上清液結(jié)果顯示與Hacat相比,Ca127和FaDu細(xì)胞可分泌大量趨化因子CXCL8。進(jìn)一步檢測BMSCs表面趨化因子受體可見CXCR2的mRNA表達(dá)較CXCR1明顯較高。抑制CXCL8與其受體CXCR2結(jié)合后Trans-well結(jié)果發(fā)現(xiàn)趨化細(xì)胞數(shù)明顯減少。3、在體內(nèi)實驗中,金納米簇為一種2-3nm大小,紅色熒光的低毒性材料,可高效標(biāo)記BMSCs。裸鼠成瘤后尾靜脈注射BMSCs,24h后小動物活體成像顯示腫瘤部位可見明顯熒光,而抑制劑組熒光在裸鼠體內(nèi)彌散,無集聚。冰凍切片顯示BMSCs組可見在腫瘤間質(zhì)中出現(xiàn)大量標(biāo)記的BMSCs,抑制劑組在腫瘤部位標(biāo)記的BMSCs稀少。研究結(jié)論:口腔鱗癌可以經(jīng)CXCL8-CXCR2途經(jīng)募集骨髓中的BMSCs趨化至口腔鱗癌的腫瘤微環(huán)境。
【圖文】：

２．２．１邐口腔淲癌組織內(nèi)可見大量的ＢＭＳＣｓ來源細(xì)胞逡逑通過免疫組織熒光雙染色ＢＭＳＣｓ的標(biāo)志物ＣＤ１０５和上皮標(biāo)志物Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ逡逑共定位，觀察圖２．１可以發(fā)現(xiàn)：ＯＳＣＣ內(nèi)ＣＤ１０５＋的ＢＭＳＣｓ廣泛分布，以Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ逡逑標(biāo)記癌巢后，可見ＢＭＳＣ廣泛分布于腫瘤間質(zhì)中，，而在腫瘤實質(zhì)中很少分布。逡逑ｕｉ逡逑ＣＤ１０５＋Ｅ－ｃａｄ逡逑圖２．１免疫組織熒光染色檢測ＢＭＳＣ的分布（１０ｘ１０）逡逑２．２．２邐ＢＭＳＣｓ表面受體檢測逡逑復(fù)蘇后的ＢＭＳＣｓ傳代培養(yǎng)至第２代，形態(tài)穩(wěn)定，倒置顯微鏡觀察可見：逡逑ＢＭＳＣｓ多數(shù)細(xì)胞呈長梭形，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核呈橢圓形或腎形，細(xì)胞突向兩側(cè)逡逑１１逡逑

表型結(jié)果顯示：ＢＭＳＣｓ特異性ｂ表面抗原高表達(dá)：ＦＩＴＣ標(biāo)記的ＣＤ９０：邋９９．９３％；逡逑ＦＩＴＣ標(biāo)記的ＣＤ１０５：邋９２．６６％；邋ＰＥ標(biāo)記的ＣＤ４４：邋９９．４７％；造血系抗原低表達(dá)：逡逑ＰＥ邋標(biāo)記的ＣＤ４５：邋１．０１％邋和ＦＩＴＣ標(biāo)記的ＣＤｌｌｂ：邋２．１１％邋（圖２．２）。逡逑邐１■丨邋■邋｜邋｜逡逑９９．９３％邐｜邋９２．６６％邐９９．４７％邋Ｉ逡逑：Ｕ＿：ｌ邋Ｘ邋！■邋：ｌ邋—逡逑ｓ－＼邐２．１１％逡逑！；：逡逑圖２．２流式細(xì)胞術(shù)檢測ＢＭＳＣｓ細(xì)胞表面受體逡逑２．２．３體外ＢＭＳＣｓ歸巢至□腔鱗癌細(xì)胞逡逑利用Ｔｒａｎｓ－ｗｅｌ丨共培養(yǎng)體系檢測ＢＭＳＣ的歸巢。熒光顯微鏡下觀察可見，與逡逑空白對照組、正常上皮細(xì)胞組相比，Ｃａｌ２７組和ＦａＤｕ組可趨化更多的ＢＭＳＣｓ，且逡逑具有統(tǒng)計學(xué)意義，如圖２．３所示。逡逑■：邐＇邐．邐？邐，：產(chǎn)邐５００１邐邐邐邐逡逑■嫊薇邐邐Ｔ逡逑ｉ邋？邐＿逡逑Ｈ－ＤＭＥＭ邐Ｈａｃａ．邐｜邋３00：邐■逡逑ＨＨ：ＨＨ邋ｚ邋0Ｕ邋ｓ邋■■丨逡逑Ｃａｌ２７邐ＦａＤｕ逡逑圖２．３熒光顯微鏡觀察ＢＭＳＣ細(xì)胞的歸巢（２０ｘ１０）逡逑１２逡逑
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.8

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本文編號：2648097