發(fā)布時(shí)間：2020-04-23 14:36

【摘要】： 保存牙髓活力是牙髓生物學(xué)基礎(chǔ)研究的主要內(nèi)容和牙髓病治療學(xué)發(fā)展的主要目標(biāo)。隨著分子生物學(xué)、組織工程學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展,牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體的再生已展示出誘人的應(yīng)用前景和科學(xué)價(jià)值。 本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)hDPCs,觀察hDPCs在離體牙髓腔內(nèi)生長(zhǎng)和分化情況,以及EDMPs對(duì)hDPCs增殖和分化的影響,以期為組織工程化牙髓的研制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分人牙髓細(xì)胞體外培養(yǎng) 材料和方法收集因正畸需要新鮮拔除的前磨牙(18～30歲),無菌條件下劈冠取出牙髓,采用組織塊酶解法進(jìn)行hDPCs的原代培養(yǎng)。傳代時(shí)制取細(xì)胞爬片,通過HE染色來觀察細(xì)胞形態(tài),同時(shí)采用細(xì)胞免疫化學(xué)染色對(duì)細(xì)胞來源進(jìn)行鑒定。另外,通過連續(xù)8d細(xì)胞計(jì)數(shù)描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 結(jié)果hDPCs體外生長(zhǎng)特點(diǎn)為梭形成纖維細(xì)胞樣,有2～3個(gè)突起,免疫化學(xué)染色顯示細(xì)胞漿中波形絲蛋白呈陽(yáng)性表達(dá),角蛋白無表達(dá),證明細(xì)胞為間充質(zhì)來源。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線近似“S”形,3～7d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,經(jīng)計(jì)算,hDPCs的PDt為27.6h。 結(jié)論實(shí)驗(yàn)證實(shí)該細(xì)胞為hDPCs,體外培養(yǎng)生長(zhǎng)穩(wěn)定,為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 第二部分人牙髓細(xì)胞在離體牙髓腔內(nèi)生長(zhǎng)和分化的研究 材料和方法收集新鮮拔除的無齲后牙,截取牙冠,慢球鉆去除髓腔內(nèi)壁的前期牙本質(zhì)層,經(jīng)10%EDTA、19%檸檬酸、75%乙醇處理后接種hDPCs,培養(yǎng)2周后4%多聚甲醛固定,10%甲酸脫鈣約20d后脫水、透明、浸蠟、包埋、切片,進(jìn)行HE染色和Masson三色法染色,顯微鏡下觀察。 結(jié)果hDPCs在經(jīng)處理后的牙本質(zhì)表面生長(zhǎng)狀態(tài)良好,部分標(biāo)本中可見在牙本質(zhì)表面有3～5層扁平狀細(xì)胞緊密貼附于牙本質(zhì)表面生長(zhǎng)。在另外部分標(biāo)本中,細(xì)胞排列疏松呈星網(wǎng)狀,并可看到細(xì)胞伸出明顯的突起伸入牙本質(zhì)小管中。 結(jié)論通過體外培養(yǎng),hDPCs在牙本質(zhì)表面可以表現(xiàn)為成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的形態(tài),為組織工程化牙髓的研制提供參考。 第三部分牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖和分化的影響 材料和方法取生長(zhǎng)穩(wěn)定的第3～5代細(xì)胞,制備成細(xì)胞懸液后接種至96孔板,分別加入含EDMPs的培養(yǎng)液、礦化誘導(dǎo)液和普通培養(yǎng)液,利用MTT比色法連續(xù)8d檢測(cè)hDPCs的增殖情況;另取生長(zhǎng)穩(wěn)定的第3～5代細(xì)胞,制備成細(xì)胞懸液后接種至25mL培養(yǎng)瓶,分別加入含EDMPs 10 ug/mL、含EDMPs 1 ug/mL的培養(yǎng)液、礦化誘導(dǎo)液和普通培養(yǎng)液,培養(yǎng)3周后茜素紅染色,觀察hDPCs的礦化情況。 結(jié)果MTT比色法結(jié)果顯示,從第3天起光吸收值EDMPs組＞礦化誘導(dǎo)液組＞普通培養(yǎng)液組,3組的總體差異具有顯著性(P＜0.05)。礦化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,培養(yǎng)7d左右,含EDMPs 10 ug/mL組、含EDMPs 1 ug/mL組和礦化誘導(dǎo)液組細(xì)胞呈復(fù)層生長(zhǎng),含EDMPs 10ug/mL組和含EDMPs 1 ug/mL組12d時(shí)在漩渦的中心處開始出現(xiàn)致密鈣化結(jié)節(jié),培養(yǎng)3周后進(jìn)行茜素紅染色,含EDMPs 10 ug/mL組、含EDMPs 1 ug/mL組形成較大的紅色鈣化結(jié)節(jié),礦化誘導(dǎo)液組所形成的鈣化結(jié)節(jié)較小,空白對(duì)照組無鈣化結(jié)節(jié)形成。 結(jié)論EDMPs對(duì)體外培養(yǎng)的hDPCs的增殖和分化有一定的作用,為進(jìn)一步探討牙髓損傷修復(fù)機(jī)制和組織工程化牙髓的研制提供參考。
【圖文】：

砂_、零圖1一 3hDPCs鑒定AB牙健細(xì)胞免疫化學(xué)顯示細(xì)胞裝中波形絲蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)(二 100)牙健細(xì)胞免疫化學(xué)顯示細(xì)胞漿中角蛋白無表達(dá)(‘100)聲聲、 ~___一/，， ，， ____ZZZ ///// /////廣廣一 ___尸尸 ZZZ護(hù)護(hù)尸卜尸丫l，111

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