發(fā)布時間：2020-04-21 03:37

【摘要】：目的:研究β1腎上腺素能受體(β1-AR)及β2腎上腺素能受體(β2-AR)在CD133~+口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)干細(xì)胞、OSCC細(xì)胞系Cal-27、SAS、SCC-9及正�？谇火つぜ�(xì)胞中的表達(dá);研究阻滯β2-AR對CD133~+OSCC干細(xì)胞與OSCC細(xì)胞系增殖、遷移及侵襲的影響;以基因高通量測序篩選β2-AR被阻滯及β2-AR未被阻滯的CD133~+OSCC干細(xì)胞的差異表達(dá)基因,從基因轉(zhuǎn)錄組層面和基因表達(dá)方向探究β2-AR與OSCC腫瘤干細(xì)胞在口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的作用。方法:應(yīng)用胰蛋白酶消化的方法對正�？谇火つさ镊[狀上皮細(xì)胞進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。同時應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR及Western Blot技術(shù)測定β1-AR與β2-AR在6例CD133~+OSCC干細(xì)胞、3例OSCC細(xì)胞系(Cal27、SAS及SCC9)及6例正�？谇火つど掀ぜ�(xì)胞中的表達(dá)。應(yīng)用Cell Counting Kit-8(CCK-8)實(shí)驗方法研究不同濃度的β2-AR特異阻滯劑ICI118,551對3例CD133~+OSCC干細(xì)胞和2例OSCC細(xì)胞系(SAS及SCC9)增殖的影響。然后以集落形成實(shí)驗檢測β2-AR特異阻滯劑ICI118,551對CD133~+OSCC干細(xì)胞單細(xì)胞增殖能力的影響。而后采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗探究不同濃度的β2-AR特異阻滯劑ICI118,551對CD133~+OSCC干細(xì)胞和OSCC細(xì)胞系SCC9遷移的影響。再以Transwell實(shí)驗研究不同濃度的β2-AR特異阻滯劑ICI118,551對CD133~+OSCC干細(xì)胞和OSCC細(xì)胞系SCC9侵襲的影響。最終通過基因高通量測序技術(shù)構(gòu)建β2-AR受到阻滯與未受到阻滯的CD133~+OSCC干細(xì)胞的差異表達(dá)基因譜,并應(yīng)用Gene Ontology(GO)富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析對篩選得到的表達(dá)明顯差異的基因進(jìn)行功能分析。結(jié)果:實(shí)時熒光定量PCR及Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)β1-AR與β2-AR在CD133~+OSCC干細(xì)胞組、OSCC細(xì)胞系(Cal27、SAS及SCC9)的表達(dá)均高于正�？谇火つど掀ぜ�(xì)胞組。CCK-8實(shí)驗結(jié)果顯示CD133~+OSCC干細(xì)胞與SCC9、SAS在不同濃度的ICI118,551藥物作用48小時后,藥物濃度越高則細(xì)胞的存活率越低,0.1μM、0.5μM、1μM、2.5μM及5μM與0μM比較,各藥物濃度間的細(xì)胞存活率差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。集落形成實(shí)驗結(jié)果顯示加藥組3個孔集落數(shù)(個)分別為30、30及32,集落形成率(%)為61.33±2.31(n=3);對照組3個孔集落數(shù)(個)分別為34、35及37,集落形成率(%)為70.67±3.06(n=3),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗結(jié)果示SCC9及CD133~+OSCC干細(xì)胞的遷移率隨藥物ICI118,551的濃度的上調(diào)而逐漸下降(P0.05);藥物濃度為0.1μM、0.5μM、1μM、2.5μM、5μM及7.5μM時SCC9及CD133~+OSCC干細(xì)胞的遷移率與藥物濃度為0μM時的遷移率比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Transwell實(shí)驗結(jié)果示SCC9及CD133~+OSCC干細(xì)胞的侵襲率隨藥物ICI118,551的濃度的上調(diào)而逐漸下降(P0.05);藥物濃度為0.1μM、0.5μM、1μM、2.5μM、5μM、7.5μM與10μM時SCC9及CD133~+OSCC干細(xì)胞的侵襲率與藥物濃度為0μM時的侵襲率比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)�；蚋咄繙y序在加藥組和對照組中篩選得到994個差異表達(dá)基因,其中用藥后有237個基因表達(dá)上調(diào),757個基因表達(dá)下調(diào)。經(jīng)GO分析,差異表達(dá)基因注釋到分子功能(Molecular Function,MF)的有118類,注釋到細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)的有92類、注釋到生物學(xué)進(jìn)程(Biological Process,BP)的有856類。KEGG分析結(jié)果顯示差異表達(dá)基因富集于細(xì)胞周期、MAPK信號通路、癌癥相關(guān)微小RNA、癌癥相關(guān)通路、PI3K-Akt信號通路與Ras信號通路等19條信號通路。結(jié)論:β1-AR及β2-AR在CD133~+OSCC干細(xì)胞、OSCC細(xì)胞系中的表達(dá)均顯著高于正�？谇火つぜ�(xì)胞。阻滯β2-AR可抑制CD133~+OSCC干細(xì)胞、OSCC細(xì)胞系的增殖、遷移及侵襲能力。阻滯β2-AR后,CD133~+OSCC干細(xì)胞發(fā)生顯著變化的基因主要富集于組織發(fā)育(tissue development)、細(xì)胞增殖(cell proliferation)、上皮細(xì)胞分化(epithelial cell differentiation)、細(xì)胞遷移(cell migration)及細(xì)胞運(yùn)動(cell motility)等生物進(jìn)程;并且這些差異表達(dá)的基因可能在一定程度上通過MAPK、PI3K/Akt與Ras等信號通路參與OSCC的發(fā)生與發(fā)展。
【圖文】：

圖3-1口腔正常黏膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)。5天后于4×10倍鏡下觀察(a),14天后于4×10倍鏡下觀察 (b),21天后于 4×10 倍鏡下觀察(c), 21 天后于 10×10 倍鏡下觀察(d)Figure.3-1 Culture of normal oral mucosal epithelial cells. Observation under 4 x 10-fold microscope after5 days (a); Observation under 4 x 10-fold microscope after 14 days (b); Observation under 4 x 10-foldmicroscope after 21 days (c) ; Observation under 10 x 10-fold microscope after 21 days (d).

腺素受體阻滯劑對口腔鱗狀細(xì)胞癌干細(xì)胞增殖遷移侵襲的作用機(jī)制研究 β1-AR 的 mRNA 在口腔鱗狀細(xì)胞癌 CD133+干細(xì)胞、口腔 Cal27、SCC9 及 SAS 和正�？谇火つど掀ぜ�(xì)胞中均有表達(dá)量分別為 3.66±0.37、7.70±0.38、18.06±0.91、1.45±0.1 3-2，β1-AR 的 mRNA 在口腔鱗狀細(xì)胞癌 CD133+干細(xì)胞黏膜上皮細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；β腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系 Cal27 中的表達(dá)高于口腔黏膜上皮學(xué)意義（P＜0.001）；β1-AR 的 mRNA 在口腔鱗狀細(xì)胞表達(dá)高于口腔黏膜上皮細(xì)胞，，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜RNA 在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系 SAS 中的表達(dá)高于口腔具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R739.8

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本文編號：2635315