【摘要】： 目的:口腔癌占全身惡性腫瘤發(fā)病率的5%,是當(dāng)前世界上最常見的十大惡性腫瘤之一,其中,90%的口腔癌為上皮源性的鱗狀細(xì)胞癌。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),我國每年約有8000名患者死于本病,盡管包括手術(shù)、放療、化療在內(nèi)的各種方法都在不斷改進(jìn),但口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous carcinoma cell,OSCC)患者的五年生存率僅為50%左右,它嚴(yán)重威脅著人民的生命和健康。近年來口腔癌的發(fā)病率不但沒有降低,反而有上升且發(fā)病年輕化的趨勢,因而尋找積極有效的預(yù)防途徑及有效的藥物成為一項(xiàng)十分迫切的重要任務(wù)。 血管生成是原發(fā)性腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及浸潤到鄰近正常組織的重要環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)研究及臨床資料表明,腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移都依賴于血管生成。與正常血管相比,腫瘤新生血管結(jié)構(gòu)迂曲,血流不規(guī)則,通透性增加。大量研究表明,血管生成活性增強(qiáng)與多種惡性腫瘤的不良預(yù)后有關(guān),包括口腔癌。血管生成是一復(fù)雜的過程,是促血管生成因子和血管穩(wěn)定因子共同作用的結(jié)果,涉及多種途徑,最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化,組成一有功能的血管網(wǎng)。而抑制血管生成過程、從而阻止腫瘤生長已成為實(shí)體瘤治療學(xué)研究的新熱點(diǎn)。 環(huán)氧化酶(COX)是催化花生四烯酸合成前列腺素過程中的重要的限速酶,有2種同工酶:COX-1和COX-2。近期的研究表明,COX-2參與了人類多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,在多種腫瘤組織包括頭頸部癌中均可檢測到COX-2的表達(dá),COX-2抑制劑具有抗腫瘤作用。目前對口腔鱗癌發(fā)病中COX-2的作用及血管生成的機(jī)制知之甚少,COX-2表達(dá)與腫瘤血管新生的相互關(guān)系如何,我們還不得而知。本研究擬探討選擇性COX-2抑制劑尼美舒利(Nimesltde,NIM)對人舌鱗癌Yca-8113細(xì)胞體外釋放PGE_2的影響,同時觀察對COX-2和VEGF、Ang-1、Ang-2的抑制作用,以探討選擇性COX-2抑制劑尼美舒利對舌鱗癌血管生成的影響。 方法: 1.放射免疫(radioimmunoassay,RIA)測定尼美舒利對人舌鱗癌Tca-8113細(xì)胞體外釋放PGE_2的影響 2.采用RT-PCR技術(shù)測定不同藥物濃度作用后細(xì)胞COX-2、VEGF、Ang-1、Ang-2 mRNA的表達(dá)情況。 3.采用免疫印跡(Western-blot)法測定細(xì)胞COX-2和VEGF、Ang-1、Ang-2的蛋白表達(dá)變化。 4.以人舌鱗癌Tca-8113細(xì)胞建立荷瘤裸鼠動物模型,分組后預(yù)防組以尼美舒利30mg/kg/天于造瘤前一天起每日灌胃,治療組以尼美舒利30mg/kg/天于成瘤后每日灌胃,對照組以生理鹽水每日灌胃,連續(xù)36d,觀察藥物對裸鼠及移植瘤生長的影響。 5.采用RT-PCR技術(shù)測定藥物作用后裸鼠移植瘤COX-2、VEGF、Ang-1、Ang-2 mRNA的表達(dá)情況。 6.采用Western-blot法測定裸鼠移植瘤內(nèi)COX-2和VEGF、Ang-1、Ang-2的蛋白表達(dá)變化。 7.SABC免疫組化法測定34例人口腔鱗癌組織及16例正常口腔黏膜組織中Ang-1、Ang-2、Tie-2、CD34的表達(dá)情況。 結(jié)果: 1.RIA法檢測顯示,實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞培養(yǎng)上清中PGE2基礎(chǔ)表達(dá)量基本相同,加入尼美舒利后,上清液中PGE_2水平下降,隨著藥物濃度及干預(yù)時間的延長,PGE_2水平下降更為明顯,在一定藥物劑量和作用時間內(nèi)呈濃度和時間依賴性。 2.RT-PCR檢測COX-2、VEGF、Ang-1、Ang-2mRNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明,不同濃度的NIM(25、50、100、200μmol/L)處理人舌鱗癌Yca-8113細(xì)胞48h后,NIM的各處理組與對照組之間COX-2水平進(jìn)行比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);NIM的各處理組與對照組之間VEGF水平進(jìn)行比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);NIM的各處理組與對照組之間Ang-1水平進(jìn)行比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);NIM的各處理組與對照組之間Ang-2水平進(jìn)行比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 3.Western-blot檢測COX-2、VEGF、Ang-1、Ang-2蛋白表達(dá)顯示不同濃度的NIM(25、50、100、200 mol/L)處理人舌鱗癌Tca-8113細(xì)胞48h后,NIM的各處理組與對照組之間COX-2蛋白進(jìn)行比較,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組與對照組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),50μmol/L組與10μmol/L組相比蛋白表達(dá)的量雖有所下降但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。COX-2mRNA的表達(dá)下降呈濃度依賴性;NIM的各處理組與對照組之間NEGF水平進(jìn)行比較,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組與對照組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),50μmol/L組與100μmol/L組相比蛋白表達(dá)的量雖有所下降但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。VEGF蛋白的表達(dá)下降呈濃度依賴性;NIM的各處理組與對照組之間Ang-1水平進(jìn)行比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),25μmol/L組與50μmol/L組、50μmol/L組與100μmol/L相比蛋白表達(dá)的量雖有所下降但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。NIM的各處理組與對照組之間Ang-2水平進(jìn)行比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),25μmol/L組與50μmol/L組相比蛋白表達(dá)的量雖有所下降但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 4.在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)3組動物全部存活。3組裸鼠均有舌鱗癌原位移植瘤的生長,其瘤組織經(jīng)病理切片檢查證實(shí)為舌鱗癌。 5.裸鼠對照組腫瘤體積為4.2956±2.06cm~3,治療組腫瘤的體積為2.2661±1.37cm~3,顯著小于對照組((P＜0.05),腫瘤生長抑制率為47.2%。預(yù)防組腫瘤的體積為1.8705±0.87cm~3,顯著小于對照組((P＜0.05),腫瘤生長抑制率為56.5%。但與治療組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 6.RT-PCR檢測裸鼠移植瘤組織中COX-2、VEGF、Ang-1、Ang-2mRNA的表達(dá),NIM預(yù)防組、治療組的COX-2mRNA表達(dá)顯著下降,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與對照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而預(yù)防組與治療組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NIM預(yù)防組、治療組的VEGFmRNA表達(dá)顯著下降,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與對照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而預(yù)防組與治療組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NIM預(yù)防組、治療組的Ang-1mRNA表達(dá)雖有所下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NIM預(yù)防組、治療組的Ang-2mRNA表達(dá)顯著下降,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與對照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而預(yù)防組與治療組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 7.Western-blot檢測裸鼠移植瘤組織中COX-2、VEGF、Ang-1、Ang-2蛋白的表達(dá),NIM預(yù)防組、治療組的COX-2蛋白表達(dá)顯著下降,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與對照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而預(yù)防組與治療組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NIM預(yù)防組、治療組的VEGF蛋白表達(dá)顯著下降,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與對照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而預(yù)防組與治療組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NIM預(yù)防組、治療組的Ang-1蛋白表達(dá)雖有所下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NIM預(yù)防組、治療組的Ang-2蛋白表達(dá)顯著下降,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與對照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而預(yù)防組與治療組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 8.口腔鱗癌患者CD34陽性細(xì)胞表達(dá)顯著高于正常口腔黏膜者。Ang-1在口腔鱗癌的表達(dá)與口腔正常黏膜組比較,無明顯差異(P＞0.05)。Ang-2在口腔鱗癌的表達(dá)明顯高于口腔正常黏膜組(P＜0.001)。病理分級后各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且與血管生成量呈正相關(guān)。說明Ang-2的表達(dá)在口腔鱗癌中表達(dá)明顯上調(diào),并隨著腫瘤惡性程度增高其表達(dá)水平進(jìn)一步升高。Tie-2在口腔鱗癌組織的表達(dá)明顯高于口腔正常黏膜組(P＜0.05),但未發(fā)現(xiàn)其表達(dá)在鱗癌組織各病理分級之間存在明顯差異(P＞0.05)。 結(jié)論: 1.尼美舒利在一定的時間和濃度范圍內(nèi),呈時間和劑量依賴性抑制體外培養(yǎng)的人舌鱗癌Tca-8113細(xì)胞的PGE2的釋放。 2.作用48h后,尼美舒利在25-200mmol/L的濃度范圍內(nèi),可在mRNA和蛋白水平呈濃度依賴性抑制Tca-8113細(xì)胞COX-2、VEGF、Ang-1、Ang-2的表達(dá)。 3.成功建立了人舌鱗癌Tca-8113細(xì)胞裸鼠異體移植瘤模型。 4.在36d的治療時間內(nèi),尼美舒利30mg/kg每日灌胃可顯著抑制舌癌裸鼠異體移植瘤的生長。并可在mRNA水平及蛋白水平抑制舌鱗癌的血管生成。 5.尼美舒利對人舌鱗癌體內(nèi)、外血管生成的抑制作用是COX-2依賴性的。 6.首次觀察了尼美舒利對人舌鱗癌Yca-8113細(xì)胞裸鼠異體移植瘤的預(yù)防作用。 7.Ang-2在口腔鱗癌的表達(dá)明顯上調(diào),并隨著腫瘤惡性程度增高其表達(dá)水平進(jìn)一步升高。其作為腫瘤血管新生的標(biāo)志之一,可能和口腔鱗癌的血管生成有關(guān)。
【圖文】：

IM(50林mol/L)40.243士22.019*#31.931士11.832*#26.663士22.685IM(100林mol/L)37.210士18.368*#31.227士8.036*#21.557士1.540*IM(200林mol/L)35·710士5.714*#28.046士0.987*#18.400士7.070*注*表示NIM不同濃度組與對照組的比較，在P<0.05時差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;#表示24、48小時組與72小時組比較，，在P<0.05時差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.表2析因設(shè)計(jì)中的方差分析結(jié)果(PGEZ水平)來源自由度平方和(DF)(TyPelll55)均方F值P值(Souree)GrouP(MeanSquare)

本文編號：2634014