【摘要】：舌癌是常見的頭頸部惡性腫瘤,由于其淋巴、血運豐富,早期易發(fā)生淋巴結轉移,雖然針對舌癌的病因、進展、臨床轉歸及治療方法方面進行了大量的研究,有關舌癌的發(fā)生機制仍不十分清楚,臨床治療效果仍有待進一步提高。針對包括舌癌在內(nèi)的頭頸部惡性腫瘤的預防方法、探索有效地治療手段及提高患者生存率一直是研究的重點。研究認為,舌癌的發(fā)生與口腔癌前病變的存在及癌變有密切關系,臨床常見癌前病變包括口腔黏膜白斑、黏膜紅斑和人類乳頭狀瘤等是口腔癌相關的危險因素,它們的共同特征是病理學表現(xiàn)都伴有上皮異常增生。 口腔腫瘤形成受到多種遺傳因素的影響,如癌基因或者抑癌基因的改變。從口腔上皮異常增生發(fā)展到癌變的過程中有大量的相關因子參與,其中包括：凋亡調(diào)節(jié)異常、異常DNA表達和大量組織標記物的表達的改變。環(huán)氧化酶-2(Cycloxygenas-2, COX-2)作為近年來發(fā)現(xiàn)的與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的的表達異常發(fā)揮重要作用,通過選擇性COX-2抑制劑抑制COX-2的活性,成為口腔癌預防及治療新的熱點。實驗及臨床觀察證明,COX-2抑制劑作為輔助治療,增強腫瘤放、化療的敏感性,并減少胃腸道并發(fā)癥的發(fā)生,因此提示我們采用COX-2抑制劑干預口腔癌前病變白斑惡變的可能性,對口腔癌的預防具有重要作用。 本研究針對COX-2與口腔黏膜發(fā)生癌前狀態(tài)病變及口腔癌發(fā)病的相關性,以及口腔黏膜局部用藥易吸收的特點,通過DMBA化學誘導建立SD大鼠舌癌模型,并局部應用COX-2抑制劑塞來昔布抑制進行干預,研究局部應用塞來昔布抑制口腔上皮異常增生發(fā)生及惡變的作用,觀察塞來昔布抑制DMBA誘導的舌癌形成過程中對凋亡前體蛋白caspase-3、survivin的表達的影響,從凋亡機制方面探討COX-2抑制劑的抗腫瘤作用與促凋亡之間的關系,為局部應用COX-2抑制劑預防口腔白斑的發(fā)生及惡變提供實驗依據(jù)。 80只SD大鼠隨機分成2組,對照組及實驗組各40只。對照組(A組)為單純舌癌建模組,分為A1、A2、A3和A4組,每組10只。將SD大鼠麻醉后,用砂紙擦拭大鼠的左側舌緣黏膜,致舌黏膜充血但不滲血,然后用特細描筆在其舌緣涂抹1%的7,12-二甲基苯并蒽丙酮溶液,每周3次。實驗組(B組)為塞來昔布局部用藥組,分為B1、B2、B3和B4組,每組10只,在給予與A組相同的處理后,給予6%塞來昔布膏劑(南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥實驗室協(xié)助配制),每天一次。觀察各組大鼠的生存狀態(tài)、體重變化和腫瘤形成率。分別于第8、12、16和20周處死大鼠,每次每組10只。處死后切取整個舌體組織,并將舌組織分為兩部分,首先取新鮮病變部分組織500 mg,置于-80℃冰箱保存剩余部分10%中性福爾馬林溶液固定。采用光鏡下觀察DMBA誘導的SD大鼠癌變過程中舌黏膜變化情況,并用Image-pro plus軟件進行分析,測量各個標本組織上皮層厚度,每樣本上皮取10個點位進行測量后取均值；采用免疫組化染色和Western blot的方法檢測舌組織中caspase-3、survivin蛋白的表達；采用RT-PCR檢測mRNA表達caspase-3、survivin mRNA水平變化。 研究結果表明：在8周的實驗組和對照組中均無腫瘤的發(fā)生；在12周、16周和20周,對照組癌變率為分別為20%、60%和70%,而實驗組則僅僅在20周有2只大鼠發(fā)生舌黏膜癌變,其癌變率為20%。整個實驗過程中對照組的癌變率為37.5%,實驗組為5%,兩組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn),隨著DMBA的刺激時間增加,實驗組與對照組的上皮厚度逐漸增加。上皮平均厚度檢測結果顯示,對照組在8、12和16周的上皮平均厚度分別為(103.40±29.40)μm、(108.70±33.80)μm、(105.30±27.50)μm,在20周的大鼠樣本舌黏膜全部發(fā)生病變,未進行上皮厚度的比較,而實驗組在8、12、16和20周的上皮平均厚度分別為(77.30±21.80)μm、(63.80±22.10)μm、(88.30±31.70)μm和(95.00±36.20)μm。整個實驗組與對照組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.012)；異常增生病變的上皮厚度比較中,異常增生病變的上皮厚度比較中,對照組和實驗組無顯著差異(P=0.052),實驗組和對照組均未顯示藥物干預對異常增生厚度產(chǎn)生影響。在角蛋白層厚度的比較中,同樣也顯示實驗組比對照組增厚程度低(P=0.000)；在炎癥浸潤程度比較中,對照組隨著DMBA的刺激時間增加,炎癥浸潤程度逐漸增加,8、12、16和20周的單元面積(5184μm2)炎癥細胞數(shù)為,6.77±2.36、10.74±10.02、17.68±13.20和17.22±13.88,而實驗組8、12、16和20周單元面積內(nèi)炎癥細胞數(shù)為9.30±2.59、10.04±3.01、9.02±2.08和9.70±3.36,實驗組炎癥浸潤程度較對照組炎癥浸潤程度低,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.047)。 免疫組化檢測結果顯示,對照組caspase-3隨著DMBA刺激時間的增加表達下降,在8、12、16和20周的平均陽性細胞率分別為(61.36±6.16)%、(51.18±10.97)%、(48.11±9.57)%和(39.73±11.07)%,差異有統(tǒng)計學意義(p=0.000),而實驗組caspase-3則未出現(xiàn)明顯變化,8、12、16和20周的平均陽性細胞率分別為(75.23±7.00)%、(76.75±7.39)%、(79.83±8.56)%和(71.66±16.57)%,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.394)。但整個實驗組caspase-3的陽性細胞率明顯高于整個對照組caspase-3表達,兩組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。對照組survivin的陽性細胞率隨著DMBA作用時間的增加而逐漸增強,在8、12、16和20周的平均陽性細胞率分別為(12.45±6.07)%、(26.50±20.16)%、(46.33±24.97)%和(58.49±35.94)%,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000),而實驗組survivin則表達并未出現(xiàn)明顯變化,在8、12、16和20周的平均陽性細胞率分別為(6.66±3.88)%、(6.45±3.45)%、(5.76±3.87)%和(11.51±12.20)%,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.242),實驗組survivin的陽性細胞率低于對照組survivin的表達率,兩組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。Western blot分析也證實,對照組caspase-3隨著DMBA刺激時間的延長而表達下降,其不同時間點的表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000),而實驗組中caspase-3的表達強度并沒有因DMBA作用時間的延長而出現(xiàn)變化,其不同時間點的表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.05),但其表達強度明顯高于對照組,兩組之間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。Western blot檢測同樣證實,對照組survivin隨DMBA作用時間的延長而增加,其不同時間點的表達差異有有統(tǒng)計學意義(P=0.000),而實驗組survivin的表達雖然也隨在DMBA刺激時間的增加而增加,其各時間段的差異有統(tǒng)計學意義(P=0.049),但其表達強度明顯低于對照組,兩組之間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。 RT-PCR結果顯示,對照組caspase-3 mRNA表達水平隨著DMBA作用時間的延長而逐漸下降,在8、12、16和20周的caspase-3/β-actin表達比值分別為0.73±0.12、0.68+0.18、0.48±0.22和0.39±0.22,各時間點差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000),而實驗組caspase-3/β-actin表達比值無顯著差異,8、12、16和20周caspase-3/β-actin值分別為0.93+0.18、0.97±0.07、0.88±0.17和0.82±0.19,各時間點差異無統(tǒng)計學意義P=0.195)。實驗組caspase-3 mRNA的表達水平明顯高于對照組,兩組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.004)。對照組在8、12、16和20周survivin /β-actin表達比值分別為0.57±0.12、0.72±0.17、0.77+0.15和0.80±0.11,各時間點之間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000),而實驗組survivin/β-actin表達比值無顯著差異,在8、12、16和20周的平均表達比值分別為0.29±0.10、0.26±0.10、0.36±0.09和0.39±0.11,各時間點之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.125),整個實驗組survivin mRNA表達水平低于整個對照組Survivin表達,差異有統(tǒng)計學意義?(P=0.000)。 通過本實驗,我們認為：局部應用6%COX-2抑制劑塞來昔布膏劑能有效的抑制DMBA化學誘導SD大鼠舌癌的發(fā)生,其作用除了與抑制口腔上皮異常增生有關外,更重要的是調(diào)節(jié)與細胞凋亡發(fā)生有關的caspase-3、survivin蛋白及mRNA的表達,其可通過上調(diào)節(jié)caspase-3以及下調(diào)survivin蛋白及及mRNA的表達,繼而影響細胞的凋亡,這對于進一步探索COX-2抑制劑與舌癌形成,以及應用COX-2抑制劑預防口腔癌前狀態(tài)發(fā)生惡變以及舌癌發(fā)生提供實驗依據(jù)。
【圖文】：

.2圖1.實驗動物的建模及藥物干預過程A:給予大鼠藥物干預前，麻醉動物;B:用砂紙擦拭實驗老鼠的舌緣豁膜;C:大鼠舌勃膜新生物的觀察，測量;D:處死大鼠后取下的舌體標本Figure1.EXPerimentalanimalmodelanddruginterveniionProcessA:Ratsweregivenanesthesiabeforedrugintervention:B:MueosaafterwiPingwithsandPaPer:C:Newbiologiealofrattonguemueosa:D:TonguesPeeimenS病理組織形態(tài)學觀察

圖2.不同實驗時期舌組織組織學光鏡觀察A:8周實驗組正常舌組織(HE，xl00);B:20周實驗組癌變舌組織(HE，xlOO)C:12周對照組癌變舌組織(HE，，xl00);D:16周對照組癌變舌組織(HE，xlOO)E:20周對照組癌變舌組織(HE，xl00);F:20周對照組癌變舌組織(HE，xZOO)Figure2.LightmicroscoPePicturesshowingmorphologyofrattonguetissues.A:normaltonguetissueofsthwee此e即erimental卿叩(HE，x100);
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R739.8

【參考文獻】

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本文編號：2631554