【摘要】：口干癥,是主要由舍格倫綜合征與激素水平下降所引起的常見(jiàn)疾病,具體表現(xiàn)為唾液流量的客觀減少及唾液成分的改變。唾液功能紊亂會(huì)導(dǎo)致口腔功能受損,患者常常因唾液流量的降低,而造成口腔粘膜萎縮、創(chuàng)傷,齲齒猖撅及義齒摘戴困難等癥狀,對(duì)生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面影響�？诟砂Y目前缺乏特效的治療藥物,硫酸羥氯喹和雌激素仍是目前治療口干癥最常用的藥物,但可能伴隨嚴(yán)重的視網(wǎng)膜毒性,并增加器官損傷、感染或罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。由于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所存在的缺陷,比如化學(xué)藥物的毒副反應(yīng)和手術(shù)等介入療法給患者產(chǎn)生的危害和痛苦,近半個(gè)多世紀(jì)以來(lái),醫(yī)藥界大力開(kāi)展天然藥物的研究工作,且取得了令人矚目的成績(jī)。一些得到科學(xué)驗(yàn)證的藥物提取物已經(jīng)得到了普遍的認(rèn)可,并應(yīng)用于臨床研發(fā)。水通道蛋白5(aquaporin5,AQP5)是唾液腺分泌過(guò)程中重要的水通道蛋白之一,近年來(lái)已被視為是控制唾液分泌的靶分子。課題組為篩選出能夠特異性促進(jìn)唾液腺分泌的藥物單體,建立以AQP5為靶點(diǎn)的藥物篩選系統(tǒng)。我們?cè)谥委熆诟砂Y的傳統(tǒng)中藥成方的主要功能性藥物單體中,選取與雌激素及與臨床已有的陽(yáng)性藥——硫酸羥氯喹具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物單體。藥物篩選范圍確認(rèn)后,我們利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)芹菜素可明顯激活A(yù)QP5啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,并發(fā)現(xiàn)芹菜素的激活作用呈劑量依賴性。接下來(lái),通過(guò)western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同藥物單體對(duì)人唾液腺潤(rùn)管細(xì)胞(HSG)中AQP5表達(dá)水平的調(diào)控作用,并進(jìn)一步驗(yàn)證了芹菜素對(duì)AQP5表達(dá)的促進(jìn)作用。為探究芹菜素對(duì)AQP5的調(diào)節(jié)機(jī)制,課題組通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬實(shí)驗(yàn)(Autodock)分析單體對(duì)性激素受體的結(jié)合能力,結(jié)果表明芹菜素對(duì)ERβ的結(jié)合能力明顯高于ERα、AR。在轉(zhuǎn)染AQP5的293T細(xì)胞中分別沉默與過(guò)表達(dá)ERα、ERβ與AR,利用雙熒光素酶報(bào)告基因探究不同的性激素受體對(duì)外源性AQP5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的激活作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)ERβ后AQP5啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性可被明顯激活。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及western blot的試驗(yàn)方法,發(fā)現(xiàn)HSG在芹菜素作用條件下,過(guò)表達(dá)ERβ與沉默AR后的AQP5表達(dá)量明顯提升;而過(guò)表達(dá)ERα或AR則對(duì)AQP5的表達(dá)水平影響不大�；诩�(xì)胞水平的初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們利用摘除雙側(cè)卵巢的8周齡雌性ICR小鼠模擬絕經(jīng)期口干模型小鼠,并另外選用同齡大小的雌性舍格倫綜合征模型鼠,通過(guò)灌胃方法以硫酸羥氯喹、芹菜素、雌激素等藥物干預(yù)12周,研究藥物的體內(nèi)效應(yīng)及作用機(jī)制。在藥物干預(yù)期間檢測(cè)小鼠的體重、唾液量、飲水量,計(jì)算出各組小鼠的平均飲水量指數(shù)及唾液分泌指數(shù)并做好記錄。結(jié)果表明,與ICR小鼠假手術(shù)組相比,模型組ICR小鼠的唾液分泌明顯減少,飲水量增多,口干癥狀較為顯著;而與模型組相比,芹菜素干預(yù)下的小鼠唾液分泌量增多,飲水量減少,芹菜素糾正口干癥狀明顯。與SS模型小鼠陰對(duì)照組相比,芹菜素組SS模型小鼠能促進(jìn)唾液的分泌并減少飲水量。此外,小鼠的血項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果顯示,芹菜素能夠提升小鼠的免疫細(xì)胞含量,從而提升其免疫水平。以上結(jié)果表明,芹菜素能夠顯著緩解小鼠由舍格倫綜合征及絕經(jīng)期造成的口干癥狀,并在一定程度上提升了自身的免疫能力。在本實(shí)驗(yàn)中,課題組通過(guò)以AQP5位靶點(diǎn)的藥物篩選,發(fā)現(xiàn)了芹菜素可以激活A(yù)QP5啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,并可以促進(jìn)HSG細(xì)胞中AQP5的表達(dá);并通過(guò)對(duì)藥物調(diào)控機(jī)制的探究,發(fā)現(xiàn)芹菜素可能通過(guò)ER β通路靶向調(diào)控AQP5的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,我們驗(yàn)證了芹菜素可以促進(jìn)小鼠唾液腺分泌并同時(shí)減少飲水的攝入,緩解小鼠由舍格倫綜合征及絕經(jīng)期造成的口干癥狀,提升免疫水平,為藥物研發(fā)提供了新的方向,對(duì)臨床治療口干癥的意義重大。
【圖文】：

為篩選出能夠特異性促進(jìn)唾液腺分泌的藥物單體，建立以ＡＱＰ５為靶點(diǎn)的藥逡逑物篩選系統(tǒng)，我們?cè)谥委熆诟砂Y的傳統(tǒng)中藥成方的主要功能性藥物單體中選擇與逡逑雌激素及硫酸羥氯喹具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物單體（如圖１）。逡逑白藜蘆＾邐蝙蝠島堿邐蟲(chóng)草素邋＞邐靈芝酸Ａ邐鉤栥n逡逑°邋：Ｖ邋＾邋％邋ｖ逡逑Ｓ邋入一邋Ｓ邐，逡逑地黃苷Ｄ邐延胡索甲素邐延胡索乙素原阿片堿逡逑ｆ邋ｆ邋＆逡逑毛蕊異黃ＳＨ邐芹菜素邐大黃酚邐大黃酸邐芒枘花素逡逑松丨、ｉｃｘｖ＇ｒｒ�。卞义希倪姡斑姡板义蠄D１邋１５種與雌激素及硫酸羥氯喹具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物單體結(jié)構(gòu)逡逑實(shí)驗(yàn)室前期己經(jīng)從人類(lèi)基因組中成功克隆出大小為９６４ｂｐ的ＡＱＰ５啟動(dòng)子序逡逑列，并成功獲得了熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒。藥物篩選范圍確認(rèn)后，我們選用逡逑相同濃度（１０＿６Ｍ）的不同藥物單體作用于２９３Ｔ細(xì)胞，并以ＰＢＳ組作為陰對(duì)照，逡逑利用ＡＱＰ５啟動(dòng)子細(xì)胞模型篩選發(fā)現(xiàn)，芹菜素、芒柄花素、白藜蘆醇等藥物可以逡逑１７逡逑

逡逑激活ＡＱＰ５的啟動(dòng)子活性，結(jié)果見(jiàn)圖２。逡逑ｐＧＬ２－ＡＱＰ５邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ逡逑０．０１２－１邋＊逡逑圖２不同藥物單體對(duì)ＡＱＰ５啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響逡逑（＊邋Ｐ＜０．邋０５邋＊＊邋Ｐ＜０．邋０１邋＊＊＊邋Ｐ＜０．邋００１）逡逑３．１．２芹菜素可明顯促進(jìn)人頜下腺潤(rùn)管上皮細(xì)胞中ＡＱＰ５的蛋白表達(dá)逡逑根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因藥物篩選結(jié)果，除去原阿片堿、鉤藤堿及蝙蝠葛堿逡逑三種對(duì)ＡＱＰ５啟動(dòng)子活性有明顯抑制作用的中藥單體，我們選取余下的１２種藥逡逑物進(jìn)一步探究中藥單體對(duì)ＡＱＰ５蛋白表達(dá)的影響。逡逑實(shí)驗(yàn)選擇藥物濃度為１０＿６Ｍ不同中藥單體成分作用于人頜下腺閏管上皮細(xì)逡逑胞（ＨＳＧ）邋，邋４８小時(shí)后，細(xì)胞收樣，通過(guò)ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ＨＳＧ細(xì)胞中的逡逑ＡＱＰ５蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖３所示。以ｐ－ａｃｔｉｎ作為內(nèi)對(duì)照，，ＰＢＳ組為對(duì)照組，逡逑芹菜素上調(diào)ＡＱＰ５蛋白表達(dá)的能力最強(qiáng)。逡逑１８逡逑
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R781

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本文編號(hào)：2631334