【摘要】： 人類牙齒發(fā)育是一個連續(xù)的過程,經(jīng)歷了蕾狀期、帽狀期、鐘狀期和牙根發(fā)育期。牙冠發(fā)育完成以后,成釉器內(nèi)釉、外釉上皮在頸環(huán)處增生,向未來根尖孔方向生長,形成兩層上皮的鞘,被稱為Hertwig上皮根鞘(Hertwig’s epithelial root sheath,HERS)。牙齒發(fā)育是外胚上皮和神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)相互作用的結(jié)果,而牙根是在HERS和周圍外胚間充質(zhì)的相互作用下形成的。HERS在牙根形成中可能起著以下作用:誘導(dǎo)牙乳頭細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞,形成根部牙本質(zhì);當(dāng)根部牙本質(zhì)開始礦化時,HERS斷裂,牙囊細(xì)胞與HERS接觸被誘導(dǎo)分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞,生成牙骨質(zhì);HERS還有可能直接參與牙骨質(zhì)的形成。 由于HERS在牙根發(fā)育中是暫時性結(jié)構(gòu),而且僅由兩層上皮細(xì)胞構(gòu)成,細(xì)胞數(shù)量少且被外胚間充質(zhì)細(xì)胞包繞,故從牙胚中單獨(dú)分離HERS細(xì)胞相當(dāng)困難。迄今為止,關(guān)于HERS細(xì)胞分離培養(yǎng)的報道還很少,HERS的生物學(xué)特性和在牙根發(fā)育中的具體作用都還不太清楚。本課題的目的是尋找牙根發(fā)育中的合適時機(jī),分離培養(yǎng)HERS細(xì)胞,進(jìn)一步研究HERS的生物學(xué)特性和其在牙根發(fā)育中的作用,為牙根發(fā)育和組織工程牙根研究提供實(shí)驗和理論依據(jù)。 本課題采用組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、RT-PCR、體內(nèi)種植和體外培養(yǎng)等技術(shù)方法進(jìn)行了以下四部分實(shí)驗研究,主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下: 第一部分大鼠磨牙牙根發(fā)育中HERS的觀察 實(shí)驗一、采用組織學(xué)方法系統(tǒng)觀察了出生后(postnatal, PN)SD大鼠下頜第一磨牙牙根發(fā)育時序,應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察了HERS在牙根發(fā)育中的生物學(xué)行為,結(jié)果發(fā)現(xiàn):PN5d時,SD大鼠下頜第一磨牙HERS開始形成,牙根發(fā)育啟動;PN15d時,在根分叉和牙頸部,牙根硬組織形成,HERS斷裂;HERS發(fā)生斷裂時形態(tài)拉長,斷裂后呈圓形或立方形;PN35d時,HERS完全斷裂,牙根發(fā)育完成。 實(shí)驗二、采用免疫組織化學(xué)方法檢測了牙根發(fā)育中HERS和周圍外胚間充質(zhì)增殖活力的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn):PN5d和PN7-8d時,HERS增殖力較強(qiáng);PN15d時,HERS末端保持較強(qiáng)增殖力,但牙胚頸部的HERS增殖力減弱,并發(fā)生斷裂;PN25d時,根尖處增殖細(xì)胞主要是間充質(zhì)細(xì)胞;HERS周圍的間充質(zhì)始終保持旺盛的增殖力。結(jié)果表明:HERS的斷裂可能是其增殖力減弱,周圍間充質(zhì)保持旺盛增殖力而產(chǎn)生的增殖力差異所致。綜合考慮HERS的生長、增殖力和實(shí)驗操作難度,PN7-8d是分離培養(yǎng)SD大鼠HERS細(xì)胞的適宜時機(jī)。 第二部分HERS細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和生物學(xué)特性的初步研究 實(shí)驗一、通過機(jī)械分離牙胚頸部組織,酶消化法原代混合培養(yǎng),差別消化法去除成纖維樣細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)的方法,分離培養(yǎng)并純化了SD大鼠HERS細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn):本實(shí)驗分離的牙胚頸部組織僅包含牙乳頭、HERS和牙囊三種組織;原代培養(yǎng)細(xì)胞為混雜細(xì)胞,包括成纖維樣細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞;經(jīng)3次差別消化和角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng),成纖維樣細(xì)胞被完全去除,剩余的貼壁細(xì)胞全部為上皮樣細(xì)胞;免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗證實(shí)上皮樣細(xì)胞為上皮來源細(xì)胞,RT-PCR檢測顯示純化的上皮細(xì)胞中無間充質(zhì)細(xì)胞混雜。結(jié)果表明:我們獲得了純化的HERS細(xì)胞,為進(jìn)一步研究HERS細(xì)胞的生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。 實(shí)驗二、通過掃描電鏡觀察、MTT檢測和RT-PCR等方法對HERS細(xì)胞的一些生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn):HERS細(xì)胞表面有發(fā)達(dá)的微絨毛和細(xì)胞連接;HERS細(xì)胞生長增殖較牙胚間充質(zhì)細(xì)胞緩慢;在礦化誘導(dǎo)條件下,HERS細(xì)胞可形成鈣鹽沉積;HERS細(xì)胞與成釉器細(xì)胞有所不同,除表達(dá)AMBN和OCN外不表達(dá)其它牙齒礦化相關(guān)蛋白。結(jié)果表明:HERS細(xì)胞呈現(xiàn)典型上皮細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)特征;HERS細(xì)胞雖來源于成釉器,但與成釉器細(xì)胞有所不同。 第三部分HERS細(xì)胞和牙胚頸部間充質(zhì)細(xì)胞的相互作用 實(shí)驗一、分別收集HERS細(xì)胞和牙胚頸部間充質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)液(conditioned media, CM),用于互相培養(yǎng),MTT法測定生長曲線,觀察兩種細(xì)胞在生長增殖方面的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn):用HERS細(xì)胞的CM培養(yǎng)時,牙胚頸部間充質(zhì)細(xì)胞的生長增殖無明顯變化;反之,用牙胚頸部間充質(zhì)細(xì)胞的CM培養(yǎng)時,HERS細(xì)胞生長增殖明顯加快。結(jié)果表明:HERS細(xì)胞對牙胚頸部間充質(zhì)細(xì)胞的生長增殖無明顯作用,反之,牙胚頸部間充質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)HERS細(xì)胞的生長增殖。另外,本實(shí)驗成功建立了研究HERS和牙胚間充質(zhì)相互作用的實(shí)驗?zāi)Ｐ汀?實(shí)驗二、通過ALP活性檢測、RT-PCR和細(xì)胞團(tuán)體內(nèi)種植方法,分析HERS細(xì)胞CM培養(yǎng)對牙胚頸部間充質(zhì)細(xì)胞分化的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn):HERS細(xì)胞CM作用于牙胚頸部間充質(zhì)細(xì)胞,可使其ALP活性提高,DSPP、DMP1、BSP、OPN、OCN和ALP mRNA表達(dá)增加,并且使其在體內(nèi)分化的成牙本質(zhì)細(xì)胞和形成的管狀牙本質(zhì)增多。結(jié)果表明:HERS可促進(jìn)牙胚頸部間充質(zhì)細(xì)胞的分化。 第四部分HERS在牙胚和牙胚頸部組織的體內(nèi)種植和體外培養(yǎng)中作用的研究 實(shí)驗一、將PN7-8d的SD大鼠下頜第一磨牙完整牙胚植入母鼠腎被膜下,大網(wǎng)膜和皮下,4周后對種植牙胚進(jìn)行組織學(xué)觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn):植入的牙胚能夠在體內(nèi)種植部位發(fā)育出結(jié)構(gòu)較完整和形態(tài)較好的牙根和牙周組織,而且沒有明顯的免疫排斥和炎癥反應(yīng)。結(jié)果表明:牙根可以在體內(nèi)異位環(huán)境下繼續(xù)發(fā)育,其關(guān)鍵可能在于選擇體內(nèi)種植牙胚的發(fā)育時機(jī),即牙根發(fā)育已啟動的時機(jī);HERS在牙根發(fā)育中起著重要作用,是牙根發(fā)育不可或缺的組織;利用母鼠體內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)仔鼠牙胚組織,是研究牙齒發(fā)育和培養(yǎng)組織工程牙齒的理想動物模型。 實(shí)驗二、PN7-8d的SD大鼠下頜第一磨牙牙胚被分切成冠部和頸部兩部分,分別通過流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期,并分別植入母鼠腎被膜下。結(jié)果發(fā)現(xiàn):絕大多數(shù)牙胚頸部細(xì)胞處于G0G1期,而許多牙胚冠部細(xì)胞進(jìn)入S期和G2期;牙胚頸部組織在腎被膜下發(fā)育出結(jié)構(gòu)較完整和形態(tài)較好的牙根和牙周組織,而牙胚冠部則無此類發(fā)育現(xiàn)象。結(jié)果表明:PN7-8d的SD仔鼠下頜第一磨牙牙胚的頸部組織處于牙根發(fā)育前的準(zhǔn)備期;牙根發(fā)育的基本組織是包括HERS在內(nèi)的牙胚頸部組織。 實(shí)驗三、體外立體培養(yǎng)PN7-8d的大鼠仔鼠下頜第一磨牙牙胚,觀察牙胚發(fā)育情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):體外培養(yǎng)12d時,牙胚體積和結(jié)構(gòu)基本維持不變,但隨后牙胚發(fā)生萎縮;整個體外培養(yǎng)過程中,未見到牙胚繼續(xù)發(fā)育牙根。結(jié)果表明:本實(shí)驗成功構(gòu)建了出生后牙胚的體外立體培養(yǎng)模型,但可能由于牙根發(fā)育調(diào)控因素的復(fù)雜性,未能使牙胚在體外繼續(xù)發(fā)育牙根。 實(shí)驗四、使用不同的酶消化方法,將HERS離散為單個細(xì)胞或碎片,并和牙乳頭細(xì)胞、牙囊細(xì)胞一起離心形成細(xì)胞團(tuán),細(xì)胞團(tuán)在體外培養(yǎng)4h后植入母鼠腎被膜下,4周后觀察組織發(fā)育情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):含有HERS碎片的細(xì)胞團(tuán)形成了牙根和牙周組織樣結(jié)構(gòu),含有離散HERS細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)僅形成了管狀牙本質(zhì)。結(jié)果表明:HERS的雙層上皮結(jié)構(gòu)對引導(dǎo)正常牙根的發(fā)育具有重要作用,失去結(jié)構(gòu)的HERS引導(dǎo)牙根生成的能力是有限的。 實(shí)驗五、切取PN25d的SD大鼠的根端組織,植入母鼠腎被膜下,4周后觀察發(fā)育情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):SD大鼠牙根根端組織在腎被膜下可發(fā)育出牙齒根尖樣的組織結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明:PN25d的SD大鼠磨牙根端組織仍具有形成牙根和牙周組織的能力,但可能由于其自身含有的HERS減少,其發(fā)育牙根和牙周組織的能力有所下降。
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文牙骨質(zhì)細(xì)胞、牙骨質(zhì)細(xì)胞和牙周膜（圖1）[13]。田鼠磨牙頸部大部分保持頸環(huán)結(jié)構(gòu)，僅在牙根樣結(jié)構(gòu)區(qū)可見到HERS，這些HERS同樣在牙根結(jié)構(gòu)形成時斷裂。圖 1 田鼠磨牙的牙根樣結(jié)構(gòu)區(qū)[13]Tummers[13]認(rèn)為牙根發(fā)育的決定要素在于頸環(huán)的歸宿。從牙齒發(fā)育早期  帽狀期開始，牙源性上皮分層，在其根尖端出現(xiàn)由幾層不同的上皮組成的頸環(huán)結(jié)構(gòu)，在切牙和磨牙中都出現(xiàn)。當(dāng)牙冠發(fā)育接近完成時，頸環(huán)有兩種發(fā)育歸宿：一種是保持頸環(huán)結(jié)構(gòu)，不斷形成釉質(zhì)，使牙齒不斷生長而不形成牙根；另一種是發(fā)育出HERS結(jié)構(gòu)，，誘導(dǎo)根部牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)形成，發(fā)育生成牙根。小鼠磨牙是頸環(huán)完全轉(zhuǎn)向牙根的例子，而田鼠磨牙僅部分完成了這種轉(zhuǎn)換

有研究表明Notch、成纖維細(xì)胞生長因子10(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)和骨形成蛋白4（bone morphogenetic protein，BMP）對維持上皮干細(xì)胞龕具有重要作用（圖2）[13,15]，可能是所有不斷生長牙齒的共同分子調(diào)控途徑。圖2 頸環(huán)干細(xì)胞龕的維持機(jī)制[13]Yokohama-Tamaki[16]等發(fā)現(xiàn)FGF10基因敲除的小鼠切牙頸環(huán)干細(xì)胞龕缺損，將基因敲除小鼠切牙頸部移植到成年鼠腎被膜下，其唇側(cè)發(fā)育出牙根結(jié)構(gòu)；向體外培養(yǎng)的小鼠切牙頸部中加入中和FGF10的抗體可導(dǎo)致頸環(huán)細(xì)胞凋亡；向體外培養(yǎng)的小鼠磨牙牙胚局部轉(zhuǎn)染FGF10 cDNA，造成FGF10過表達(dá)，17
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R78

【引證文獻(xiàn)】

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1 白玉娣;大鼠切牙Apical bud和磨牙Hertwig’s上皮根鞘細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

本文編號：2628728