【摘要】：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?慢性牙周炎是由菌斑微生物始發(fā)、宿主免疫炎癥反應(yīng)及其他多種因素共同導(dǎo)致的牙齒支持組織破壞性疾病,其發(fā)生與發(fā)展與全身系統(tǒng)性疾病密切相關(guān),其主要致病菌是以牙拃卟琳單胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)為主的革蘭氏陰性厭氧菌。阿爾茨海默病是較常見(jiàn)的進(jìn)行性神經(jīng)認(rèn)知障礙,腦內(nèi)淀粉樣蛋白(amyloid-β,Aβ)的異常沉積是阿爾茨海默病重要的病理標(biāo)志。眾多研究表明,慢性牙周炎和阿爾茨海默病具有相關(guān)性。我們已經(jīng)證明,牙齦卟啉單胞菌脂多糖可以誘導(dǎo)腦內(nèi)Aβ沉積。該實(shí)驗(yàn)的目的是探究在P.gingivalis感染的外周巨噬細(xì)胞中,是否會(huì)引起外周Aβ的異常表達(dá)。實(shí)驗(yàn)方法:(體內(nèi)實(shí)驗(yàn))實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立:12月齡野生雌性小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=10)和對(duì)照組(n=10)。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射三周P gingivalis,對(duì)照組腹腔注射三周等量磷酸鹽緩沖液。1.Real-time PCR檢測(cè)P.gingivalis感染后,小鼠肝臟中Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)、白細(xì)胞介素1(interleukin-1,IL-1)β、Aβ生成相關(guān)蛋白——淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)、組織蛋白酶(Cathepsin,Cat)B以及Aβ降解相關(guān)蛋白(中性內(nèi)肽酶、胰島素降解酶、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)的mRNA表達(dá)。2.免疫熒光染色觀察Pgingivalis感染后,小鼠肝臟巨噬細(xì)胞中TLR2、IL-1β、APP、CatB、Aβ的表達(dá)。(體外實(shí)驗(yàn))P.gingivalis感染小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7。3.Real-time PCR檢測(cè)P.gingivalis感染巨噬細(xì)胞系RAW264.7后,不同時(shí)間點(diǎn)TLR2、IL-lβ的mRNA表達(dá);Western blotting檢測(cè)在Cat B抑制劑和核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)抑制劑預(yù)處理下,P.gingivalis感染的巨噬細(xì)胞系RAW264.7中,IL-1β前體和IL-1β的蛋白表達(dá)。4.Real-time PCR檢測(cè)P.gingivali 感染巨噬細(xì)胞系RAW264.7后,不同時(shí)間點(diǎn)APP、Cat B的mRNA表達(dá);免疫熒光染色觀察在Cat B抑制劑和NF-κB抑制劑預(yù)處理下,P.gingivalis感染巨噬細(xì)胞系RAW264.7中,Aβ的表達(dá)。5.免疫熒光染色觀察慢性牙周炎患者牙齦組織巨噬細(xì)胞中APP、Cat B和Aβ的表達(dá)。6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Graphpad Prism7軟件,進(jìn)行單因素或雙因素方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.P.gingivalis感染誘導(dǎo)了小鼠肝臟巨噬細(xì)胞中TLR2、IL-lβ、APP、CatB、Aβ表達(dá)增加,但未影響Aβ降解酶(中性內(nèi)肽酶、胰島素降解酶、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)表達(dá)變化。巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)促炎表型。2.P.gingivalis感染巨噬細(xì)胞系RAW264.7誘導(dǎo)TLR2、IL-lβ、APP、Cat B、Aβ的表達(dá)增加,同時(shí)Cat B和NF-κB參與調(diào)控IL-lβ和Aβ的表達(dá)。3.慢性牙周炎患者牙齦組織巨噬細(xì)胞中APP、Cat B和Aβ高度表達(dá)。結(jié)論:慢性P.gingivalis感染通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路和Cat B誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)Aβ,表明在慢性牙周炎感染條件下,巨噬細(xì)胞可在外周Aβ生成過(guò)程中起重要作用。Cat B抑制劑可成為通過(guò)減少外周Aβ及炎癥反應(yīng)來(lái)預(yù)防阿爾茨海默病的新型治療靶點(diǎn)。
【圖文】：

邐感染對(duì)炎癥因子及與ＡＰ生成相關(guān)蛋白表逡逑達(dá)的影響。我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，感染雌性中年小鼠后，ＴＬＲ２逡逑和炎癥因子ＩＬ－ｌｐ在小鼠肝臟中的平均ｍＲＮＡ表達(dá)顯著增加（圖３．１Ａ）。同時(shí)，逡逑與Ａｐ生成相關(guān)蛋白——ＡＰＰ７７0和Ｃａｔ邋Ｂ在小鼠肝臟中的平均ｍＲＮＡ表達(dá)明顯增逡逑加，然而ＢＡＣＥ１的表達(dá)無(wú)顯著性差異（圖３．１Ｂ）。逡逑接下來(lái)檢測(cè)慢性系統(tǒng)性Ｐ．邐感染對(duì)ＡＰ降解酶表達(dá)的影響。ＡＰ降解逡逑酶中性內(nèi)肽酶ＮＥＰ、胰島素降解酶ＩＤＥ、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶ＡＣＥ在小鼠肝臟中逡逑的平均ｍＲＮＡ表達(dá)無(wú)顯著性差異（圖３．１Ｃ）。逡逑因此，慢性系統(tǒng)性Ｐ．邋ｇ／ｔｔｇ／ｖａｔｏ感染誘導(dǎo)了小鼠肝臟ＴＬＲ２、炎癥因子ＩＬ－ｉｐ逡逑表達(dá)增加，Ａｐ生成相關(guān)蛋白（ＡＰＰ、Ｃａｔ邋Ｂ）表達(dá)增加，但未影響Ａｐ降解相關(guān)逡逑蛋白（ＮＥＰ、ＩＤＥ、ＡＣＥ）表達(dá)變化。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑６，邐５＊逡逑ｇ邐＊＊＊□邋Ｓａｌｉｎｅ邋ｇ邐＊＊＊邐□邋Ｓａｌｉｎｅ逡逑｜邐Ｈ邋Ｐｇ邋＾邋４－邋－ｒ邐＊＊＊邐■邋Ｐｇ逡逑ｉｊｎｉ邋ｎ８邐ＩＬＬ逡逑ＴＬＲ２邐ＩＬ－ｉｐ邐ＡＰＰ邐ＣａｔＢ邐ＢＡＣＥ１逡逑ｃ逡逑１．５＾逡逑＝邐□邋Ｓａｌｉｎｅ逡逑｜邐■邋Ｐ－９逡逑Ｉ邋ｌ．0－邋￣￣邐￣邋Ｔ邋￣ＩＴ逡逑ｒｌｌＭｌ逡逑°＇邋ＮＥＰ

３．２邋Ｐ．邋ｇ／嘆／ｗｉｔｏ感染促進(jìn)ＴＬＲ２和ＩＬ－ｉｐ在肝臟巨噬細(xì)胞中表達(dá)逡逑免疫焚光染色顯示，與對(duì)照組相比，尸．感染雌性中年小鼠后，ＴＬＲ２逡逑在小鼠肝臟巨噬細(xì)胞中表達(dá)顯著增加（圖３．２Ａ、Ｃ），ＩＬ－ｉｐ在巨噬細(xì)胞中表達(dá)逡逑也顯著增加（圖３．２Ｂ、Ｃ）。逡逑由此可見(jiàn)，慢性系統(tǒng)性Ｐ．邐感染誘導(dǎo)ＴＬＲ２和ＩＬ－ｌｐ在巨噬細(xì)胞中逡逑表達(dá)增加，肝臟巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)促炎表型。逡逑ｃ逡逑＊＊＊邋ｎ邋Ｓａｌｉｎｅ逡逑１，５－邐＊＊＊邐Ｔｍｐ．ａ逡逑ｉＬＬｑＩ逡逑Ｉ邐ＴＬＲ２邐ＩＬ－ｉｐ逡逑圖３．邋２邋Ａ邋＾７Ａ７＾７Ｖａ／／ｓ感染促進(jìn)ＴＬＲ２和丨Ｌ－１邋（３在肝臟巨卩筮細(xì)胞中表達(dá)逡逑Ａ：免疫熒光染色顯示對(duì)照組和Ｐ．ｇｈｇ／ｖａｔｅ感染小鼠肝臟中ＴＬＲ２邋（綠色）和巨噬細(xì)胞（Ｉｂａｌ，，逡逑紅色）共定位表達(dá)（ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ邋＝邋１５ｐｍ）逡逑１４逡逑
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R781.4

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本文編號(hào)：2622324