【摘要】：實驗目的:慢性牙周炎是由菌斑微生物始發(fā)、宿主免疫炎癥反應及其他多種因素共同導致的牙齒支持組織破壞性疾病,其發(fā)生與發(fā)展與全身系統(tǒng)性疾病密切相關,其主要致病菌是以牙拃卟琳單胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)為主的革蘭氏陰性厭氧菌。阿爾茨海默病是較常見的進行性神經認知障礙,腦內淀粉樣蛋白(amyloid-β,Aβ)的異常沉積是阿爾茨海默病重要的病理標志。眾多研究表明,慢性牙周炎和阿爾茨海默病具有相關性。我們已經證明,牙齦卟啉單胞菌脂多糖可以誘導腦內Aβ沉積。該實驗的目的是探究在P.gingivalis感染的外周巨噬細胞中,是否會引起外周Aβ的異常表達。實驗方法:(體內實驗)實驗動物模型建立:12月齡野生雌性小鼠隨機分為實驗組(n=10)和對照組(n=10)。實驗組腹腔注射三周P gingivalis,對照組腹腔注射三周等量磷酸鹽緩沖液。1.Real-time PCR檢測P.gingivalis感染后,小鼠肝臟中Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)、白細胞介素1(interleukin-1,IL-1)β、Aβ生成相關蛋白——淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)、組織蛋白酶(Cathepsin,Cat)B以及Aβ降解相關蛋白(中性內肽酶、胰島素降解酶、血管緊張素轉化酶)的mRNA表達。2.免疫熒光染色觀察Pgingivalis感染后,小鼠肝臟巨噬細胞中TLR2、IL-1β、APP、CatB、Aβ的表達。(體外實驗)P.gingivalis感染小鼠巨噬細胞系RAW264.7。3.Real-time PCR檢測P.gingivalis感染巨噬細胞系RAW264.7后,不同時間點TLR2、IL-lβ的mRNA表達;Western blotting檢測在Cat B抑制劑和核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)抑制劑預處理下,P.gingivalis感染的巨噬細胞系RAW264.7中,IL-1β前體和IL-1β的蛋白表達。4.Real-time PCR檢測P.gingivali 感染巨噬細胞系RAW264.7后,不同時間點APP、Cat B的mRNA表達;免疫熒光染色觀察在Cat B抑制劑和NF-κB抑制劑預處理下,P.gingivalis感染巨噬細胞系RAW264.7中,Aβ的表達。5.免疫熒光染色觀察慢性牙周炎患者牙齦組織巨噬細胞中APP、Cat B和Aβ的表達。6.實驗結果采用Graphpad Prism7軟件,進行單因素或雙因素方差分析。實驗結果:1.P.gingivalis感染誘導了小鼠肝臟巨噬細胞中TLR2、IL-lβ、APP、CatB、Aβ表達增加,但未影響Aβ降解酶(中性內肽酶、胰島素降解酶、血管緊張素轉化酶)表達變化。巨噬細胞呈現(xiàn)促炎表型。2.P.gingivalis感染巨噬細胞系RAW264.7誘導TLR2、IL-lβ、APP、Cat B、Aβ的表達增加,同時Cat B和NF-κB參與調控IL-lβ和Aβ的表達。3.慢性牙周炎患者牙齦組織巨噬細胞中APP、Cat B和Aβ高度表達。結論:慢性P.gingivalis感染通過激活NF-κB信號通路和Cat B誘導巨噬細胞表達Aβ,表明在慢性牙周炎感染條件下,巨噬細胞可在外周Aβ生成過程中起重要作用。Cat B抑制劑可成為通過減少外周Aβ及炎癥反應來預防阿爾茨海默病的新型治療靶點。
【圖文】：

邐感染對炎癥因子及與ＡＰ生成相關蛋白表逡逑達的影響。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，感染雌性中年小鼠后，ＴＬＲ２逡逑和炎癥因子ＩＬ－ｌｐ在小鼠肝臟中的平均ｍＲＮＡ表達顯著增加（圖３．１Ａ）。同時，逡逑與Ａｐ生成相關蛋白——ＡＰＰ７７0和Ｃａｔ邋Ｂ在小鼠肝臟中的平均ｍＲＮＡ表達明顯增逡逑加，然而ＢＡＣＥ１的表達無顯著性差異（圖３．１Ｂ）。逡逑接下來檢測慢性系統(tǒng)性Ｐ．邐感染對ＡＰ降解酶表達的影響。ＡＰ降解逡逑酶中性內肽酶ＮＥＰ、胰島素降解酶ＩＤＥ、血管緊張素轉化酶ＡＣＥ在小鼠肝臟中逡逑的平均ｍＲＮＡ表達無顯著性差異（圖３．１Ｃ）。逡逑因此，慢性系統(tǒng)性Ｐ．邋ｇ／ｔｔｇ／ｖａｔｏ感染誘導了小鼠肝臟ＴＬＲ２、炎癥因子ＩＬ－ｉｐ逡逑表達增加，Ａｐ生成相關蛋白（ＡＰＰ、Ｃａｔ邋Ｂ）表達增加，但未影響Ａｐ降解相關逡逑蛋白（ＮＥＰ、ＩＤＥ、ＡＣＥ）表達變化。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑６，邐５＊逡逑ｇ邐＊＊＊□邋Ｓａｌｉｎｅ邋ｇ邐＊＊＊邐□邋Ｓａｌｉｎｅ逡逑｜邐Ｈ邋Ｐｇ邋＾邋４－邋－ｒ邐＊＊＊邐■邋Ｐｇ逡逑ｉｊｎｉ邋ｎ８邐ＩＬＬ逡逑ＴＬＲ２邐ＩＬ－ｉｐ邐ＡＰＰ邐ＣａｔＢ邐ＢＡＣＥ１逡逑ｃ逡逑１．５＾逡逑＝邐□邋Ｓａｌｉｎｅ逡逑｜邐■邋Ｐ－９逡逑Ｉ邋ｌ．0－邋￣￣邐￣邋Ｔ邋￣ＩＴ逡逑ｒｌｌＭｌ逡逑°＇邋ＮＥＰ

３．２邋Ｐ．邋ｇ／嘆／ｗｉｔｏ感染促進ＴＬＲ２和ＩＬ－ｉｐ在肝臟巨噬細胞中表達逡逑免疫焚光染色顯示，與對照組相比，尸．感染雌性中年小鼠后，ＴＬＲ２逡逑在小鼠肝臟巨噬細胞中表達顯著增加（圖３．２Ａ、Ｃ），ＩＬ－ｉｐ在巨噬細胞中表達逡逑也顯著增加（圖３．２Ｂ、Ｃ）。逡逑由此可見，慢性系統(tǒng)性Ｐ．邐感染誘導ＴＬＲ２和ＩＬ－ｌｐ在巨噬細胞中逡逑表達增加，肝臟巨噬細胞呈現(xiàn)促炎表型。逡逑ｃ逡逑＊＊＊邋ｎ邋Ｓａｌｉｎｅ逡逑１，５－邐＊＊＊邐Ｔｍｐ．ａ逡逑ｉＬＬｑＩ逡逑Ｉ邐ＴＬＲ２邐ＩＬ－ｉｐ逡逑圖３．邋２邋Ａ邋＾７Ａ７＾７Ｖａ／／ｓ感染促進ＴＬＲ２和丨Ｌ－１邋（３在肝臟巨卩筮細胞中表達逡逑Ａ：免疫熒光染色顯示對照組和Ｐ．ｇｈｇ／ｖａｔｅ感染小鼠肝臟中ＴＬＲ２邋（綠色）和巨噬細胞（Ｉｂａｌ，，逡逑紅色）共定位表達（ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ邋＝邋１５ｐｍ）逡逑１４逡逑
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R781.4

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