【摘要】： 牙周炎是一種慢性細(xì)菌感染性疾病，能引起牙周結(jié)締組織的破壞和牙槽骨吸收，導(dǎo)致牙齒松動、脫落。伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans，A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans)是目前公認(rèn)的牙周炎主要致病菌之一。A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans又被稱為伴放線菌嗜血菌(Haemophilus actinomycetemcomitans)，主要存在于齦下菌斑中，能合成分泌多種細(xì)胞毒力因子。大量研究發(fā)現(xiàn)，A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans和局限型侵襲性牙周炎(localized aggressive periodontitis，LAP)密切相關(guān)。在慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)患者和牙周健康者的齦下菌斑中也經(jīng)常檢測到A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans的存在，但國內(nèi)外學(xué)者對其在慢性牙周炎患者和牙周健康者齦下菌斑中分布的研究結(jié)果差異較大。 為了探索A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans在慢性牙周炎患者和牙周健康者齦下菌斑中的分布規(guī)律，本研究采用了目前國際通用的16S rRNA聚合酶鏈反應(yīng)(16S ribosomal RNA polymerase chain reaction，16S rRNA PCR)技術(shù)，檢測慢性牙周炎患者和健康人齦下菌斑中A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans的攜帶率，并分析了A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans分布與牙周臨床指標(biāo)的關(guān)系。 本研究第一部分應(yīng)用16S rRNA PCR技術(shù)檢測慢性牙周炎患者和牙周健康者齦下菌斑中的A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中重度牙周炎患牙位點的A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans檢出率為33．62％，顯著高于慢性牙周炎患者相對健康牙和牙周健康者健康牙的位點檢出率(P＜0．05)；男性和女性慢性牙周炎患者的A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans位點檢出率沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但年輕患者的位點檢出率明顯高于中、老年患者(P＜0．05)。 A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans在牙周組織破壞嚴(yán)重的患牙位點檢出率要高于破壞較輕的位點。A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans在PD≥7mm的牙周炎患牙位點的檢出率顯著高于PD 4～6mm的位點，而PD 4～6mm的患牙位點A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans檢出率又顯著高于PD≤4mm的位點(P＜0．05)。CAL對A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans檢出率的影響也呈相同趨勢，CAL≥6mm的患牙位點檢出率最高，3～5mm次之，CAL≤3mm的患牙位點A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans檢出率最低(P＜0．05)。此外，在BOP陽性位點的檢出率高于陰性位點，說明A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans在炎癥活躍期位點的分布較多。 A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans能合成分泌多種細(xì)胞毒力因子，其中細(xì)胞膨脹致死毒素(cytolethal distending toxin，CDT)是一種由三個蛋白亞基組成的異聚體，具有引起細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡和刺激炎性細(xì)胞因子分泌的功能。目前，細(xì)胞膨脹致死毒素與A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans致病性的關(guān)系已引起國外學(xué)者的廣泛關(guān)注，而國內(nèi)尚未見相關(guān)報道。 本研究第二部分采用PCR技術(shù)擴增出A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans基因組中的CDT編碼基因cdtABC，將獲取的基因片斷通過TA克隆、限制性酶切和連接，構(gòu)建出pQE60-cdtABC重組質(zhì)粒。測序報告證實重組質(zhì)粒中嵌入的cdtABC基因和原始序列的同源性高達99％。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染E．coli感受態(tài)細(xì)胞，并用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)重組CDT蛋白的表達，，通過SDS-PAGE和Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)E．coli感受態(tài)細(xì)胞的總蛋白中有重組CDT蛋白的表達。 綜上所述，慢性牙周炎患者中患牙位點的A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans檢出率顯著高于慢性牙周炎患者的相對健康位點和牙周健康者的位點檢出率。A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans在年輕的慢性牙周炎患者中檢出率高于中、老年患者，而且它的檢出率還隨著牙周組織破壞程度的加重而升高。本研究進一步利用PCR技術(shù)克隆出編碼A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans CDT的cdtABC基因，通過TA克隆成功構(gòu)建了pQE60-cdtABC載體，并在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中成功表達出重組CDT蛋白，為進一步研究CDT蛋白的生物學(xué)活性和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制以及A．a(chǎn)ctinomycetemcomitans的致病機理奠定了研究基礎(chǔ)。
【圖文】：

2結(jié)果 2.1PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果細(xì)菌通用引物進行PCR擴增后獲得的產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖1一1所示，在第1到第5泳道都可見與預(yù)期擴增片斷大小602帥相符的DNA條帶，說明己經(jīng)成功提取到釀下菌斑樣本中的細(xì)菌DNA。排除了取樣時沒有收集到細(xì)菌，或沒有提取出細(xì)菌基因組DNA的可能，為下一步A.actino州少cetemcomitans的檢測排除了假陰性結(jié)果的可能。A.actino陰少 cetemcomitansl6srRNAPcR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1一2。750b5《X】b印ZbP200b圖1一1細(xì)菌通用引物PCR產(chǎn)物電泳圖M:M別rker;一5:PeR產(chǎn)物(+) M123456789101112131415C0n500b一 443bP圖1一 165rRNAPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖M:皿d弋 r;Con:A.ac伽�？谏賑“emcom如nsATCC29533;l，2，4，5

5rRNAPCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖
【學(xué)位授予單位】：四川大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R781.4

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2621760