【摘要】：牙撕脫性損傷是指外力撞擊后牙齒由牙槽窩中脫出、牙周膜和牙髓被同時徹底撕脫的一類損傷，它是牙外傷中發(fā)生率較高的一類疾病，但其治療難度大且預(yù)后很不穩(wěn)定。大多數(shù)撕脫性患牙在就診時已出現(xiàn)牙周膜的廣泛損傷甚至壞死，勉強再植后形成病理性愈合甚至牙齒脫落。以往的研究證實，撕脫性損傷患牙的牙周愈合與牙根表面活細胞的數(shù)目，尤其是與牙周膜組織中干細胞的數(shù)量密切相關(guān)，因此，有學(xué)者對適合牙周再生的干細胞類型進行了篩選并確定牙周膜干細胞（periodontalligament stem cells, PDLSCs）為理想的種子細胞。單純地將PDLSCs用于脫位再植牙中，雖能促進其牙周愈合，但仍不能達到理想的牙周膜性愈合。究其原因，PDLSCs在牙周組織工程中可以通過兩條途徑發(fā)揮作用：一是外源性干細胞直接局部植入?yún)⑴c牙周修復(fù)，二是損傷的牙槽窩內(nèi)壁、牙根表面余留的內(nèi)源性干細胞動員、經(jīng)細胞歸巢聚集于牙周缺損區(qū)域參與修復(fù)。無論哪一種途徑，參與牙周再生的內(nèi)源性或外源性PDLSCs的分化命運都受控于其培養(yǎng)環(huán)境。在體內(nèi)，生長因子、細胞因子等信號分子形成網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的微環(huán)境，精細地調(diào)控干細胞的增殖和分化；而在體外，則需要人為地模擬體內(nèi)這種復(fù)雜的微環(huán)境，常用的方法是添加多種外源性生長因子，模擬體內(nèi)信號分子間的相互作用，從而實現(xiàn)對細胞增殖、分化的調(diào)控，最終達到形成組織的目的[1]。然而，生長因子在牙周組織工程中的應(yīng)用目前還存在很大的局限性，究其原因在于外源性生長因子存在成本高、純化難、半衰期短等問題，而且要使其在體內(nèi)維持長時間的作用，則需要一個持續(xù)傳遞的系統(tǒng)來確保生長因子能在一定時間內(nèi)維持在機體所必需的濃度水平，而生長因子的復(fù)合、控釋等問題目前都還存在技術(shù)瓶頸。富血小板衍生物的出現(xiàn)很好地解決了這一難題，其所含有的天然比例的復(fù)合生長因子能夠調(diào)控與組織修復(fù)密切相關(guān)的細胞的增殖、分化和凋亡，并且各生長因子作用的發(fā)揮并不是獨立存在的，而是相互促進、相互協(xié)同、相互調(diào)控，構(gòu)成強大的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，從而發(fā)揮促進組織修復(fù)甚至再生的作用。富血小板衍生物自發(fā)現(xiàn)以來已被用于骨、軟骨等組織缺損的修復(fù)，但其在牙周組織修復(fù)與再生中的研究較少，多限于復(fù)雜牙周病治療的個案報道，其對牙周細胞的生物學(xué)效應(yīng)及機理尚未見報道，對于其是否可在撕脫再植牙牙周損傷修復(fù)中發(fā)揮促進作用也尚不清楚。本研究則擬深入分析富血小板衍生物的制備方法及其促牙周組織修復(fù)與再生效應(yīng)，進一步采用組織工程的方法，將牙周膜干細胞作為種子細胞，并制備成細胞膜片片段形式，同時將富血小板衍生物PRP/PRF作為細胞支架材料和生長因子的來源，構(gòu)建新型高效促牙周膜再生修復(fù)的復(fù)合體移植物，以保證干細胞具有復(fù)合生長因子持續(xù)支持的微環(huán)境，以期最大程度地促進其發(fā)揮牙周組織修復(fù)和再生潛能，為突破目前脫位牙體外存留時間的極限、使原本無保留希望的延遲再植牙也能獲得理想的牙周膜性愈合提供新的思路與契機。 本實驗分為兩大部分： 第一部分：富血小板衍生物對脫位再植牙牙周膜愈合影響的研究。 1、采用不同離心方法制備富血小板血漿（PRP），對其回收的血小板數(shù)量及形態(tài)進行檢測篩選出較為理想的PRP制備方法，同時按照標(biāo)準的400g/min的離心速度制備富血小板纖維蛋白（PRF），對二者進行組織學(xué)觀察和超微結(jié)構(gòu)觀察，以明確其結(jié)構(gòu)特點。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）對二者含有的生長因子進行定量檢測及分析。 2、采用犬作為實驗動物，間隔拔除上下頜前牙，建立完全性牙脫位模型。自頸靜脈抽取全血，按照第一部分實驗方法制備PRP和PRF。將脫位牙按照體外干燥放置30min、1h和2h進行隨機化分組，每組的患牙又分別復(fù)合PRP、PRF或不添加任何移植物進行再植，以即刻再植作為對照組。采用組織學(xué)觀察評價各組患牙牙周愈合情況。 第二部分：牙周膜干細胞復(fù)合富血小板衍生物促延遲再植脫位牙牙周膜愈合的實驗研究。 1、聯(lián)合應(yīng)用酶消化法和組織塊法分離培養(yǎng)原代人牙周膜細胞，采用有限稀釋法分離PDLSCs，并對其干細胞特性進行鑒定，包括采用克隆形成實驗鑒定其克隆形成能力，采用MTT法測定其生長曲線，采用成脂、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)檢測其多向分化潛能。 2、將不同濃度的PRP和對應(yīng)劑量的PRF與自體PDLSCs共培養(yǎng)，采用MTT法檢測其對細胞活性的影響，采用細胞計數(shù)的方法檢測細胞增殖能力的變化，采用堿性磷酸酶活性測定、成骨相關(guān)基因BSP和OCN，以及成牙周膜相關(guān)基因CP23、Col-I的real-time PCR檢測明確PRP/PRF對PDLSCs分化的影響。 3、體外構(gòu)建雙膜結(jié)構(gòu)復(fù)合物PDLSCs/PRF。該部分是將PDLSCs制備成細胞膜片的形式，同時將PRF制備成堅韌的膜狀結(jié)構(gòu)，采用不同的方法對二者進行復(fù)合，對復(fù)合體的超微結(jié)構(gòu)進行觀察，篩選出二者最佳的復(fù)合方式，以便更好地將其應(yīng)用于體內(nèi)，最大程度上發(fā)揮二者的作用。 4、體外分離培養(yǎng)犬牙周膜干細胞，將其制備成細胞膜片片段的形式，體外構(gòu)建雙膜結(jié)構(gòu)復(fù)合物PDLSCs/PRF并用于犬脫位牙的延遲再植中，同時將其與PDLSCs/PRP、PDLSCs、PRP/PRF等移植物的牙周修復(fù)效果進行對比研究。 本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1、通過對全血離心可以成功制備富血小板衍生物PRP/PRF，組織學(xué)觀察證實二者均為膠原纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，均含有大量比例與生理狀況一致的生長因子，包括表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor,IGF-1）、血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor-AB, PDGF-AB）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor, TGF-β）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelialgrowth factor, VEGF）等，且PRF中的生長因子呈持續(xù)性緩慢釋放。將自體富血小板衍生物局部應(yīng)用于脫位牙再植，PRP和PRF均能明顯促進脫位牙牙周愈合，減少其病理性吸收，尤以PRF作用更為顯著，但其修復(fù)效果與脫位時間呈負相關(guān)，即延遲再植時間越久，修復(fù)效果越差。當(dāng)脫位時間突破目前再植極限2小時后，即使局部使用PRP/PRF也不能有效促進脫位牙再植后的牙周愈合。 2、有限稀釋法能夠成功分離得到PDLSCs，后者具有良好的增殖能力和克隆形成能力，具有和骨髓間充質(zhì)干細胞相似的表面分子標(biāo)志，具有向成脂、成骨等不同方向分化的潛能。富血小板衍生物PRP/PRF能夠明顯促進細胞增殖及向牙周膜方向分化，表現(xiàn)為牙周膜主要成分Col-I和牙骨質(zhì)蛋白CP23基因的上調(diào)；但其對細胞成骨分化有一定的抑制作用，表現(xiàn)為成骨相關(guān)指標(biāo)ALP活性的下降和成骨相關(guān)基因BSP、OCN的下調(diào)。 3、將PDLSCs制備成大小約0.5mm×0.5mm細胞膜片片段的形式，將PRF膜制備成大小約0.5mm×0.5mm×0.5mm的顆粒狀，二者按照一定比例機械混勻即可得到結(jié)構(gòu)良好的PDLSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)復(fù)合物。超微結(jié)構(gòu)顯示，細胞可以牢固粘附于PRF表面，并伸出大量偽足至PRF三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，二者相互嵌合，形成整體。該復(fù)合體移植物不但大幅度提高了細胞密度、保存了細胞外基質(zhì)成分，還滿足了種子細胞、支架材料和生長因子等組織工程三要素，并具有較強的可塑性。將該雙膜結(jié)構(gòu)復(fù)合物用于脫位時間超過2小時的延遲再植脫位牙，能夠明顯促進脫位牙牙周膜愈合，表現(xiàn)為膠原纖維緊密排列的牙周膜樣組織的大量再生及患牙病理性愈合的減少。 小結(jié)：本研究首次將牙周組織工程理念引入脫位牙的治療中。體外分離培養(yǎng)種子細胞PDLSCs，在充分探究了富含天然比例復(fù)合生長因子的富血小板衍生物的制備方法及其對PDLSCs的生物學(xué)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)新性地于體外構(gòu)建了基于干細胞膜片片段與PRF膜顆粒的雙膜結(jié)構(gòu)復(fù)合體PDLSCs/PRF，并將其應(yīng)用于脫位牙的延遲再植中，觀察其對延遲再植脫位牙牙周膜損傷修復(fù)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，富血小板衍生物PRP/PRF可通過顯著促進PDLSCs的增殖及牙周膜向分化，，從而發(fā)揮促脫位牙牙周膜愈合、減少其病理性吸收的作用。但當(dāng)患牙脫位時間突破目前再植極限2h后，單純局部使用PRP/PRF也不能有效促進脫位牙再植后的牙周膜愈合，此時采用外源性膜片化PDLSCs的膜片片段復(fù)合PRF膜顆粒所構(gòu)建的新型復(fù)合體移植物PDLSCs/PRF，能夠有效促進脫位2h以上患牙延遲再植后的牙周愈合，從而最大程度地促進外源性干細胞發(fā)揮其牙周再生與修復(fù)的潛能。本研究為突破目前脫位牙體外存留時間的極限、使原本無保留希望的延遲再植牙也能獲得理想的牙周膜性愈合提供了新的契機與研究基礎(chǔ)。
【圖文】：

-39-圖 1.1 三種不同離心方法制備的 PPP/PRP 中生長因子濃度的比較注：*P＜0.05,**P＜0.01.表 3 PRF 中血小板和白細胞的回收率全血x ± s.d除 PRF 膜外的混合液± s.dPRF 中回收率(%）血小板 (109/L） 221.33 ± 21.08 8.33 ± 1.53 96.39%白細胞 (109/L） 5.16 ± 0.58 1.02 ± 0.07 81.38%

圖 2.1 實驗牙位的選取表 1 實驗分組1 2 3 4 5 6 7 8 0 min 30 min 1 h - - PRP PRF - PRP PRF - 型制備及隨機化分組結(jié)果，按照如下步驟進行實驗：犬眠寧 II”鎮(zhèn)靜后，再按照 15 mg/kg 給予戊巴比妥鈉按該劑量進行麻醉維持。伏嚴密消毒，硅橡膠重體行上下頜前牙區(qū)印模制取
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R782.12

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王青福;金珍玉;孫艷清;;外傷性脫位前牙治療的臨床分析[J];深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志;2007年06期

2 鄧佩芳;;129個脫位牙治療的臨床分析[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2010年07期

3 李敬國;;牙脫位再植的臨床分析[J];基層醫(yī)學(xué)論壇;2009年28期

4 徐東靜;外傷脫位牙再植的臨床分析[J];局解手術(shù)學(xué)雜志;2001年02期

5 宋興運,潘興哲;脫位牙的臨床處理[J];國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊;1997年04期

6 劉蘊玉;王林茹;;外傷全脫位牙19小時后再植效果觀察[J];北京口腔醫(yī)學(xué);2007年04期

7 運新躍,杜濱;19顆外傷脫位牙再植的臨床分析[J];天津醫(yī)藥;1997年11期

8 汪俊;李成皓;;兒童外傷全脫位牙的應(yīng)急處理與再植后的替代性吸收[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2008年05期

9 安濤;;脫位牙60例再植的療效分析[J];山西醫(yī)藥雜志(下半月刊);2009年07期

10 王瓊超;外傷性完全性脫位牙再植的臨床分析[J];海南醫(yī)學(xué);2002年06期

相關(guān)會議論文 前10條

1 黃征難;;脫位牙再植的臨床觀察及最新進展[A];第三屆全國口腔頜面部創(chuàng)傷暨修復(fù)重建學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2003年

2 趙啟明;;自體富血小板血漿的應(yīng)用[A];2011年浙江省整形美容學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

3 孫曉雷;馬劍雄;王志剛;張華峰;馬信;;富血小板血漿聯(lián)合鈣化誘導(dǎo)對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨活性的影響[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第30次學(xué)術(shù)年會暨生物醫(yī)學(xué)工程前沿科學(xué)研討會論文集[C];2010年

4 呂開陽;夏照帆;朱世輝;肖仕初;馬兵;王長起;吳杭慶;;自體富血小板血漿對燒傷供皮創(chuàng)面愈合影響的臨床觀察[A];第八屆全國燒傷外科學(xué)年會論文匯編[C];2007年

5 楊進;陳江;閆福華;;屏障膜聯(lián)合自體骨髓基質(zhì)細胞及富血小板血漿修復(fù)牙槽骨缺損的實驗研究[A];第四屆全國口腔種植學(xué)術(shù)會議論文集[C];2005年

6 徐燕;蔣勇;;富血小板血漿對人牙周組織細胞的礦化作用影響[A];中華口腔醫(yī)學(xué)會第七屆全國口腔病理學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2006年

7 袁霆;張長青;陸男吉;李四波;曾炳芳;;富血小板血漿修復(fù)皮膚缺損的實驗研究[A];第二屆華東地區(qū)骨科學(xué)術(shù)大會暨山東省第九次骨科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2007年

8 孫一睿;孔維清;胡錦;徐建廣;;鞘內(nèi)注射富血小板血漿聯(lián)合神經(jīng)前體細胞移植在急性脊髓損傷治療中的應(yīng)用[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第四屆全國代表大會論文匯編[C];2009年

9 徐燕;PM Bartold;V Marino;;富血小板血漿和乏血小板血漿包被的屏障膜對成骨細胞附著的影響[A];中華口腔醫(yī)學(xué)會第七屆全國口腔病理學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2006年

10 李祥偉;鄭明;孫宏晨;;牙再植后引起硬組織聯(lián)合吸收的臨床病理分析[A];全國第三次牙體牙髓病學(xué)臨床技術(shù)研討會論文匯編[C];2009年

相關(guān)重要報紙文章 前4條

1 衣曉峰 商孝來;讓落牙再“歸隊”[N];中國醫(yī)藥報;2000年

2 本報記者 劉霞;用自己的血治愈自己的傷[N];科技日報;2009年

3 田洪順 何萍;關(guān)于“牙”……[N];中國醫(yī)藥報;2003年

4 副主任醫(yī)師 徐樹森　曹培虹 通訊員 徐海英;兒童牙外傷應(yīng)及早就醫(yī)[N];大眾衛(wèi)生報;2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 趙寅華;富血小板衍生物及與牙周膜干細胞復(fù)合促脫位再植牙牙周膜愈合的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

2 陳磊;富血小板血漿誘導(dǎo)肌腱干細胞增殖分化對肌腱微損傷修復(fù)的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

3 鐘達;強化磷酸三鈣/富血小板血漿凝膠復(fù)合支架材料的制備及在體內(nèi)成骨的研究[D];中南大學(xué);2008年

4 宋揚;富血小板血漿促進骨組織修復(fù)的實驗研究[D];四川大學(xué);2005年

5 張洪濤;PRP誘導(dǎo)人BMSc體內(nèi)成骨及免疫配型不相合人BMSc混合培養(yǎng)實驗研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2006年

6 田學(xué)忠;硫酸鈣對骨修復(fù)的影響及硫酸鈣富血小板血漿活性支架材料的研制[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院;2008年

7 劉勇;丙二醇/反丁烯二酰氯縮聚物復(fù)合材料在頜骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用基礎(chǔ)研究[D];吉林大學(xué);2005年

8 盧小生;富血小板血漿在山羊顱骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2006年

9 王悅;富血小板血漿對MG63，hADSCs及hDFbs細胞生物學(xué)行為影響的實驗研究[D];吉林大學(xué);2011年

10 金哲;慶大霉素—富血小板凝膠治療感染性骨缺損的實驗研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 鐘聲;富血小板血漿對脫位再植牙牙周組織愈合影響的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2006年

2 郭嬌嬌;堿性成纖維細胞生長因子對大鼠牙脫位延遲再植的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2012年

3 李會波;生物反應(yīng)器內(nèi)應(yīng)用富血小板血漿構(gòu)建組織工程骨體內(nèi)血管化的評估的實驗研究[D];山東大學(xué);2013年

4 謝蔓菁;犬自體富血小板血漿凝膠析出液對骨髓間充質(zhì)干細胞遷移作用體外研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年

5 胡通;骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2對大鼠完全脫位牙延遲再植的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2012年

6 羅濤;影響富血小板血漿凝膠生物效應(yīng)因素的體外實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

7 陳錦;兔脂肪來源干細胞分離培養(yǎng)及富血小板血漿對其增殖的影響[D];大連醫(yī)科大學(xué);2011年

8 施六霞;富血小板血漿對不同條件下人牙周膜成纖維細胞功能的影響[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

9 張寧;不同抗凝劑和激活劑組合在自體富血小板血漿凝膠支架促進脂肪干細胞增殖的影響[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院;2012年

10 徐秋;富血小板血漿對牙周膜干細胞膜片生物活性影響的研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2013年

本文編號：2621508