【摘要】：牙撕脫性損傷是指外力撞擊后牙齒由牙槽窩中脫出、牙周膜和牙髓被同時(shí)徹底撕脫的一類損傷，它是牙外傷中發(fā)生率較高的一類疾病，但其治療難度大且預(yù)后很不穩(wěn)定。大多數(shù)撕脫性患牙在就診時(shí)已出現(xiàn)牙周膜的廣泛損傷甚至壞死，勉強(qiáng)再植后形成病理性愈合甚至牙齒脫落。以往的研究證實(shí)，撕脫性損傷患牙的牙周愈合與牙根表面活細(xì)胞的數(shù)目，尤其是與牙周膜組織中干細(xì)胞的數(shù)量密切相關(guān)，因此，有學(xué)者對適合牙周再生的干細(xì)胞類型進(jìn)行了篩選并確定牙周膜干細(xì)胞（periodontalligament stem cells, PDLSCs）為理想的種子細(xì)胞。單純地將PDLSCs用于脫位再植牙中，雖能促進(jìn)其牙周愈合，但仍不能達(dá)到理想的牙周膜性愈合。究其原因，PDLSCs在牙周組織工程中可以通過兩條途徑發(fā)揮作用：一是外源性干細(xì)胞直接局部植入?yún)⑴c牙周修復(fù)，二是損傷的牙槽窩內(nèi)壁、牙根表面余留的內(nèi)源性干細(xì)胞動(dòng)員、經(jīng)細(xì)胞歸巢聚集于牙周缺損區(qū)域參與修復(fù)。無論哪一種途徑，參與牙周再生的內(nèi)源性或外源性PDLSCs的分化命運(yùn)都受控于其培養(yǎng)環(huán)境。在體內(nèi)，生長因子、細(xì)胞因子等信號(hào)分子形成網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的微環(huán)境，精細(xì)地調(diào)控干細(xì)胞的增殖和分化；而在體外，則需要人為地模擬體內(nèi)這種復(fù)雜的微環(huán)境，常用的方法是添加多種外源性生長因子，模擬體內(nèi)信號(hào)分子間的相互作用，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控，最終達(dá)到形成組織的目的[1]。然而，生長因子在牙周組織工程中的應(yīng)用目前還存在很大的局限性，究其原因在于外源性生長因子存在成本高、純化難、半衰期短等問題，而且要使其在體內(nèi)維持長時(shí)間的作用，則需要一個(gè)持續(xù)傳遞的系統(tǒng)來確保生長因子能在一定時(shí)間內(nèi)維持在機(jī)體所必需的濃度水平，而生長因子的復(fù)合、控釋等問題目前都還存在技術(shù)瓶頸。富血小板衍生物的出現(xiàn)很好地解決了這一難題，其所含有的天然比例的復(fù)合生長因子能夠調(diào)控與組織修復(fù)密切相關(guān)的細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，并且各生長因子作用的發(fā)揮并不是獨(dú)立存在的，而是相互促進(jìn)、相互協(xié)同、相互調(diào)控，構(gòu)成強(qiáng)大的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，從而發(fā)揮促進(jìn)組織修復(fù)甚至再生的作用。富血小板衍生物自發(fā)現(xiàn)以來已被用于骨、軟骨等組織缺損的修復(fù)，但其在牙周組織修復(fù)與再生中的研究較少，多限于復(fù)雜牙周病治療的個(gè)案報(bào)道，其對牙周細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)及機(jī)理尚未見報(bào)道，對于其是否可在撕脫再植牙牙周損傷修復(fù)中發(fā)揮促進(jìn)作用也尚不清楚。本研究則擬深入分析富血小板衍生物的制備方法及其促牙周組織修復(fù)與再生效應(yīng)，進(jìn)一步采用組織工程的方法，將牙周膜干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，并制備成細(xì)胞膜片片段形式，同時(shí)將富血小板衍生物PRP/PRF作為細(xì)胞支架材料和生長因子的來源，構(gòu)建新型高效促牙周膜再生修復(fù)的復(fù)合體移植物，以保證干細(xì)胞具有復(fù)合生長因子持續(xù)支持的微環(huán)境，以期最大程度地促進(jìn)其發(fā)揮牙周組織修復(fù)和再生潛能，為突破目前脫位牙體外存留時(shí)間的極限、使原本無保留希望的延遲再植牙也能獲得理想的牙周膜性愈合提供新的思路與契機(jī)。 本實(shí)驗(yàn)分為兩大部分： 第一部分：富血小板衍生物對脫位再植牙牙周膜愈合影響的研究。 1、采用不同離心方法制備富血小板血漿（PRP），對其回收的血小板數(shù)量及形態(tài)進(jìn)行檢測篩選出較為理想的PRP制備方法，同時(shí)按照標(biāo)準(zhǔn)的400g/min的離心速度制備富血小板纖維蛋白（PRF），對二者進(jìn)行組織學(xué)觀察和超微結(jié)構(gòu)觀察，以明確其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）對二者含有的生長因子進(jìn)行定量檢測及分析。 2、采用犬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，間隔拔除上下頜前牙，建立完全性牙脫位模型。自頸靜脈抽取全血，按照第一部分實(shí)驗(yàn)方法制備PRP和PRF。將脫位牙按照體外干燥放置30min、1h和2h進(jìn)行隨機(jī)化分組，每組的患牙又分別復(fù)合PRP、PRF或不添加任何移植物進(jìn)行再植，以即刻再植作為對照組。采用組織學(xué)觀察評價(jià)各組患牙牙周愈合情況。 第二部分：牙周膜干細(xì)胞復(fù)合富血小板衍生物促延遲再植脫位牙牙周膜愈合的實(shí)驗(yàn)研究。 1、聯(lián)合應(yīng)用酶消化法和組織塊法分離培養(yǎng)原代人牙周膜細(xì)胞，采用有限稀釋法分離PDLSCs，并對其干細(xì)胞特性進(jìn)行鑒定，包括采用克隆形成實(shí)驗(yàn)鑒定其克隆形成能力，采用MTT法測定其生長曲線，采用成脂、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)檢測其多向分化潛能。 2、將不同濃度的PRP和對應(yīng)劑量的PRF與自體PDLSCs共培養(yǎng)，采用MTT法檢測其對細(xì)胞活性的影響，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法檢測細(xì)胞增殖能力的變化，采用堿性磷酸酶活性測定、成骨相關(guān)基因BSP和OCN，以及成牙周膜相關(guān)基因CP23、Col-I的real-time PCR檢測明確PRP/PRF對PDLSCs分化的影響。 3、體外構(gòu)建雙膜結(jié)構(gòu)復(fù)合物PDLSCs/PRF。該部分是將PDLSCs制備成細(xì)胞膜片的形式，同時(shí)將PRF制備成堅(jiān)韌的膜狀結(jié)構(gòu)，采用不同的方法對二者進(jìn)行復(fù)合，對復(fù)合體的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，篩選出二者最佳的復(fù)合方式，以便更好地將其應(yīng)用于體內(nèi)，最大程度上發(fā)揮二者的作用。 4、體外分離培養(yǎng)犬牙周膜干細(xì)胞，將其制備成細(xì)胞膜片片段的形式，體外構(gòu)建雙膜結(jié)構(gòu)復(fù)合物PDLSCs/PRF并用于犬脫位牙的延遲再植中，同時(shí)將其與PDLSCs/PRP、PDLSCs、PRP/PRF等移植物的牙周修復(fù)效果進(jìn)行對比研究。 本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1、通過對全血離心可以成功制備富血小板衍生物PRP/PRF，組織學(xué)觀察證實(shí)二者均為膠原纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，均含有大量比例與生理狀況一致的生長因子，包括表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor,IGF-1）、血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor-AB, PDGF-AB）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor, TGF-β）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelialgrowth factor, VEGF）等，且PRF中的生長因子呈持續(xù)性緩慢釋放。將自體富血小板衍生物局部應(yīng)用于脫位牙再植，PRP和PRF均能明顯促進(jìn)脫位牙牙周愈合，減少其病理性吸收，尤以PRF作用更為顯著，但其修復(fù)效果與脫位時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，即延遲再植時(shí)間越久，修復(fù)效果越差。當(dāng)脫位時(shí)間突破目前再植極限2小時(shí)后，即使局部使用PRP/PRF也不能有效促進(jìn)脫位牙再植后的牙周愈合。 2、有限稀釋法能夠成功分離得到PDLSCs，后者具有良好的增殖能力和克隆形成能力，具有和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的表面分子標(biāo)志，具有向成脂、成骨等不同方向分化的潛能。富血小板衍生物PRP/PRF能夠明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖及向牙周膜方向分化，表現(xiàn)為牙周膜主要成分Col-I和牙骨質(zhì)蛋白CP23基因的上調(diào)；但其對細(xì)胞成骨分化有一定的抑制作用，表現(xiàn)為成骨相關(guān)指標(biāo)ALP活性的下降和成骨相關(guān)基因BSP、OCN的下調(diào)。 3、將PDLSCs制備成大小約0.5mm×0.5mm細(xì)胞膜片片段的形式，將PRF膜制備成大小約0.5mm×0.5mm×0.5mm的顆粒狀，二者按照一定比例機(jī)械混勻即可得到結(jié)構(gòu)良好的PDLSCs/PRF雙膜結(jié)構(gòu)復(fù)合物。超微結(jié)構(gòu)顯示，細(xì)胞可以牢固粘附于PRF表面，并伸出大量偽足至PRF三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，二者相互嵌合，形成整體。該復(fù)合體移植物不但大幅度提高了細(xì)胞密度、保存了細(xì)胞外基質(zhì)成分，還滿足了種子細(xì)胞、支架材料和生長因子等組織工程三要素，并具有較強(qiáng)的可塑性。將該雙膜結(jié)構(gòu)復(fù)合物用于脫位時(shí)間超過2小時(shí)的延遲再植脫位牙，能夠明顯促進(jìn)脫位牙牙周膜愈合，表現(xiàn)為膠原纖維緊密排列的牙周膜樣組織的大量再生及患牙病理性愈合的減少。 小結(jié)：本研究首次將牙周組織工程理念引入脫位牙的治療中。體外分離培養(yǎng)種子細(xì)胞PDLSCs，在充分探究了富含天然比例復(fù)合生長因子的富血小板衍生物的制備方法及其對PDLSCs的生物學(xué)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)新性地于體外構(gòu)建了基于干細(xì)胞膜片片段與PRF膜顆粒的雙膜結(jié)構(gòu)復(fù)合體PDLSCs/PRF，并將其應(yīng)用于脫位牙的延遲再植中，觀察其對延遲再植脫位牙牙周膜損傷修復(fù)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，富血小板衍生物PRP/PRF可通過顯著促進(jìn)PDLSCs的增殖及牙周膜向分化，，從而發(fā)揮促脫位牙牙周膜愈合、減少其病理性吸收的作用。但當(dāng)患牙脫位時(shí)間突破目前再植極限2h后，單純局部使用PRP/PRF也不能有效促進(jìn)脫位牙再植后的牙周膜愈合，此時(shí)采用外源性膜片化PDLSCs的膜片片段復(fù)合PRF膜顆粒所構(gòu)建的新型復(fù)合體移植物PDLSCs/PRF，能夠有效促進(jìn)脫位2h以上患牙延遲再植后的牙周愈合，從而最大程度地促進(jìn)外源性干細(xì)胞發(fā)揮其牙周再生與修復(fù)的潛能。本研究為突破目前脫位牙體外存留時(shí)間的極限、使原本無保留希望的延遲再植牙也能獲得理想的牙周膜性愈合提供了新的契機(jī)與研究基礎(chǔ)。
【圖文】：

-39-圖 1.1 三種不同離心方法制備的 PPP/PRP 中生長因子濃度的比較注：*P＜0.05,**P＜0.01.表 3 PRF 中血小板和白細(xì)胞的回收率全血x ± s.d除 PRF 膜外的混合液± s.dPRF 中回收率(%）血小板 (109/L） 221.33 ± 21.08 8.33 ± 1.53 96.39%白細(xì)胞 (109/L） 5.16 ± 0.58 1.02 ± 0.07 81.38%

圖 2.1 實(shí)驗(yàn)牙位的選取表 1 實(shí)驗(yàn)分組1 2 3 4 5 6 7 8 0 min 30 min 1 h - - PRP PRF - PRP PRF - 型制備及隨機(jī)化分組結(jié)果，按照如下步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：犬眠寧 II”鎮(zhèn)靜后，再按照 15 mg/kg 給予戊巴比妥鈉按該劑量進(jìn)行麻醉維持。伏嚴(yán)密消毒，硅橡膠重體行上下頜前牙區(qū)印模制取
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R782.12

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本文編號(hào)：2621508