【摘要】：研究背景及目的:力學刺激是細胞在生物進化過程中受到的最基本的生物刺激之一,適當?shù)臋C械力學刺激可以促進細胞的生長分化.體內實驗及臨床應用發(fā)現(xiàn)適宜的力學加載在骨折修復、正畸牙移動以及牽張成骨(頜骨發(fā)育不足的矯治、骨缺損的整復、肢體延長)等治療中,能刺激骨組織自身生長與重建。同時大量體外實驗也表明,適當?shù)膽d荷可以促進骨形成性蛋白及其受體,膠原蛋白、OPN、VEGF等的表達,誘導成骨細胞自身的分化增殖,調節(jié)其生理功能,有助于細胞基質礦化與骨重建.研究類成骨細胞及成骨前體細胞的力學信號轉導及骨細胞的生物學響應對于口腔正畸,正頜外科,口腔種植修復,牙槽骨再生,種子細胞工程學具有重要意義,但目前機械應力刺激成骨細胞的力學信號轉導機制及成骨細胞在力學環(huán)境中的生物學響應有待于繼續(xù)深入. Wnt信號通路通過調節(jié)成骨細胞的增殖、分化和功能來影響個體出生后的骨組織生長和發(fā)育。上調或下調這條途徑中各個因子的表達能夠明顯的改變成骨細胞的功能,并改變整個骨量的變化。淋巴樣增強因子-1(1ymphoid enhancer factor-l,LEF-1)是淋巴增強因子/T-細胞因子(LEF/TCF)家族的成員之一,位于人4號染色體q23-q25區(qū)域,作為一個重要的轉錄因子是Wnt信號通路的核心成分,屬于高遷移率組分(high mobility group,HMG)。研究顯示LEF-1參與Wnt信號通路,IL-7受體信號通路、TGF-β信號通路等多條信號通路的調控,具有復雜性及多啟動子特征,多結構域,多異構體的特點。LEF-1蛋白異常已在一些牙胚發(fā)育,骨組織發(fā)育,口腔惡性腫瘤如惡性黑色素瘤細胞中發(fā)現(xiàn)并引起重視,關于其在各種屬成骨(類)細胞接受機械力學刺激后的表達,目前國內外尚未見報道,通過國內外核心期刊的文獻檢索,反映Wnt通路的上游研究包括目的基因的識別傳遞,膜受體的結合,介質在胞漿的傳遞和轉移等方面涉及的研究較多,但靶基因結合后效應階段的研究尚處于起步階段.骨髓間充質干細胞或骨祖干細胞不表達典型的成骨標志基因,循環(huán)牽張力誘導轉錄因子FosB表達成骨標志基因[1],并激活Wnt信號途徑促進細胞內的力敏感基因表達[2].前成骨細胞在基因Osx的調控下,分化為典型的成骨細胞,然后分化成熟,合成和分泌細胞外基質,包括成熟早期的骨涎蛋白,中期的骨鈣素和晚期的骨橋蛋白[3-4].基于以上實驗基礎,本實驗采用力學加載裝置對來源于不同種屬的成骨前體細胞:大鼠來源的骨髓間充質干細胞(Marrow Mesenchymal Stem Cells,MSCs ),人牙周膜細胞( human periodontal ligament cells,hPDLC ) ,小鼠來源的MC3T3-E1成骨樣細胞系進行橫向研究,從細胞的基因水平和蛋白水平通過細胞受力前后LEF-1的表達改變,初步探討三種類成骨細胞在機械應力作用下LEF-1的表達,下游靶效應機制以及牽張力對細胞分化增殖特性的影響,從Wnt信號通路角度探索LEF-1的生物學功能和機械應力對于誘導骨轉化形成的分子生物學機制. 材料與方法: 1骨髓間充質干細胞(BMSCs)的原代培養(yǎng) 全骨髓貼壁法培養(yǎng)大鼠BMSCs.處死大鼠后將大鼠雙側股骨和脛骨骨骺端剪去,PBS反復沖洗骨髓腔,收集沖洗液于離心管中,離心棄上清,加入培養(yǎng)液后吹打形成單細胞懸液,接種于培養(yǎng)瓶內,常規(guī)換液傳代. 2人牙周膜細胞的原代培養(yǎng) 收集臨床上11-14歲因正畸需要拔除的牙周健康無齲的新鮮前磨牙,拔除后立即在雙抗PBS液和DMEM液中反復清洗牙齒,刮下根中1/3牙周膜組織,不經(jīng)剪切,直接置于離心管中,加入Ⅰ型膠原酶,采用酶消化法結合組織塊混合培養(yǎng)法培養(yǎng)hPDLC.取第二代細胞經(jīng)SABC免疫細胞化學檢測證實為牙周膜成纖維細胞. 3 MC3T3-E1細胞培養(yǎng) 小鼠胚胎成骨細胞系MC3T3-E1細胞復蘇后用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(內含10% FBS),每3天換液1次,細胞達80%融合時,用0.25%胰酶消化,按5×105個細胞接種至25 cm培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。 4反轉錄聚合酶鏈反應檢測加力前后三種(類)成骨細胞LEF-1的表達 1)引物設計與合成; 2)細胞總DNA的提取及逆轉錄; 3)將總DNA逆轉錄為cDNA; 4)將cDNA產(chǎn)物進行PCR擴增后,電泳檢測PCR擴增物:PCR反應結束后,在1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳,使用DL-2000 DNA Marker,所得結果拍照并掃描. 5免疫熒光雙標記 加力完畢后用4%多聚甲醛固定, 0. 2% TritonX 100透化去交聯(lián),其間2%牛血清白蛋白封閉非特異性位點。每張爬片加入30μ12%牛血清白蛋白(BSA)稀釋的非磷酸化β-catenin多克隆抗體(1∶100) ,放入濕盒1h ,避光下加入30μl2% BSA稀釋的RBITC標記山羊抗兔二抗(1∶150) ,放入濕盒1h。DAPI作用5 min ,將玻片反扣于新玻片,中間加MOVO(熒光淬滅劑) 10 ml,95%甘油封片。熒光倒置顯微鏡下分別在495 nm,527 nm激發(fā)光下觀察同一視野中的表達情況并攝像。上述實驗重復3次。每個水平每張照片選取3個不同的視野,每個視野50個細胞,用Image2pro2plus圖像分析軟件分析各個水平蛋白表達的積分光密度值(IOD). 6 ALP染色 將細胞以1×10~8/ml接種于玻片→PBS清洗蓋玻片3次→10%甲醛溶液中固定30min→蒸餾水漂洗5 min→放入孵育液、37℃孵育2h→蒸餾水漂洗5min→2%硝酸鉆液作用2min→蒸餾水漂洗5min→2%硫化胺液作用2min→蒸餾水漂洗多余的硫化胺染液,待干→2%美藍復染→樹膠封存后置于光學顯微鏡觀察。 7統(tǒng)計學分析 用Bandscan5.0對結果進行灰度值分析.以樣品的LEF-1的灰度值與同一樣品GAPDH的灰度值之比作為評價LEF-1的指標.(t檢驗) 結果 RT-PCR檢測表明,來源于不同種屬的細胞MSCs細胞,hPDLC細胞,MC3T3細胞內存在LEF-1 mRNA表達;在FSS作用下LEF-1 mRNA表達水平的升高具有規(guī)律性,但存在一定差異. 在人牙周膜細胞組,對照組LEF-1 mRNA表達微弱。加力2h,4h后,LEF-1 mRNA表達水平呈升高趨勢,加力8h LEF-1 mRNA表達水平升高至峰值,12h LEF-1 mRNA表達水平開始下降,但仍高于對照組;在MSCs細胞組對照組和2h LEF-1 mRNA表達微弱,4h組未見表達,8h組LEF-1 mRNA表達水平升高至峰值;在MC3T3-E1細胞組,對照組和2h組的LEF-1 mRNA有較弱表達,半小時和4h組LEF-1 mRNA表達下降,持續(xù)12dyn/cm 8h組的LEF-1 mRNA表達水平升高至峰值. 結論 本實驗發(fā)現(xiàn)LEF-1 mRNA在正常人牙周膜細胞的表達(未見報告).在FSS作用的12 h內,MSCs細胞,hPDLC細胞,MC3T3細胞內的LEF-1 mRNA表達呈波動增強趨勢,且在不同大小的FSS力值,不同種屬來源前提下均于8h到達LEF-1 mRNA表達峰值,該結果表明剪切應力增強LEF-1的表達,我們認為LEF-1 mRNA的表達增強是類成骨細胞經(jīng)典Wnt信號通路對剪切應力的應答反應. LEF-1蛋白的低表達是成骨細胞成熟的必要條件.LEF-1的表達未見種屬差異.
【圖文】：

本實驗梯度離心結果為:從上到下依次為血小板層,白膜層,Percoll,紅細胞層.其中白膜層為 MSCs 層,是一個單個核細胞層.結合利用SCs 的貼壁生長特性,棄去未貼壁細胞,獲得比例更大,均一性更高的大 MSCs.倒置顯微鏡下觀察: 48-72h 貼壁細胞多數(shù)呈纖維狀,換液除去未貼細胞.接種 5-7 天形成集落,14 天達到融合 85%.傳代培養(yǎng)后觀察:均勻布生長,細胞絕大部分呈長梭形,少數(shù)為三角形,胞核呈圓形或橢圓形,于細胞中央,為藍色,可見數(shù)個深藍色的核仁,胞漿為淡紅色,染色質疏.鑒定:本實驗應用免疫組化方法檢測了大鼠 MSCs 的 4 種表面抗原的達情況.結果顯示:CD34(造血干細胞標記物)陰性,排除了細胞是造血細胞的可能;CD44 陽性,ColagenⅠ陰性,Fibronectin 陽性說明了培養(yǎng)大鼠細胞是 MSCs.(圖 1,2)

本實驗梯度離心結果為:從上到下依次為血小板層,白膜層,Percoll,紅細胞層.其中白膜層為 MSCs 層,是一個單個核細胞層.結合利用SCs 的貼壁生長特性,棄去未貼壁細胞,獲得比例更大,均一性更高的大 MSCs.倒置顯微鏡下觀察: 48-72h 貼壁細胞多數(shù)呈纖維狀,換液除去未貼細胞.接種 5-7 天形成集落,14 天達到融合 85%.傳代培養(yǎng)后觀察:均勻布生長,細胞絕大部分呈長梭形,少數(shù)為三角形,胞核呈圓形或橢圓形,于細胞中央,為藍色,可見數(shù)個深藍色的核仁,胞漿為淡紅色,染色質疏.鑒定:本實驗應用免疫組化方法檢測了大鼠 MSCs 的 4 種表面抗原的達情況.結果顯示:CD34(造血干細胞標記物)陰性,排除了細胞是造血細胞的可能;CD44 陽性,ColagenⅠ陰性,Fibronectin 陽性說明了培養(yǎng)大鼠細胞是 MSCs.(圖 1,2)
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R783.5

【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

1 趙超;田曉晨;聞玉梅;;乙肝病毒表面抗原持續(xù)表達的新致病機制[J];生命科學;2010年11期

2 井燕;李良;李毅;陳孟詩;吳文超;陳槐卿;劉小菁;;力學應變對大鼠骨髓間充質干細胞增殖和成骨分化能力的影響[J];生物醫(yī)學工程學雜志;2006年03期

3 成敏;陳槐卿;李毅;吳江;;流體低剪切力上調內皮細胞IL-8基因表達的細胞內信號轉導途徑分析[J];醫(yī)用生物力學;2007年01期

4 李小彤,張丁,傅民魁,楊雁琪;機械牽張力對人牙周膜細胞成骨樣細胞功能的影響[J];中華口腔醫(yī)學雜志;2002年02期

5 邵景范;黎潤光;魏明發(fā);楊小進;陳超;王子民;趙東明;洪振亞;;牽張應力對兒童骨髓間充質干細胞體外增殖與向成骨分化的影響[J];中華小兒外科雜志;2007年06期

，

本文編號：2619012