【摘要】：研究背景及目的:力學(xué)刺激是細(xì)胞在生物進(jìn)化過程中受到的最基本的生物刺激之一,適當(dāng)?shù)臋C(jī)械力學(xué)刺激可以促進(jìn)細(xì)胞的生長分化.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)適宜的力學(xué)加載在骨折修復(fù)、正畸牙移動以及牽張成骨(頜骨發(fā)育不足的矯治、骨缺損的整復(fù)、肢體延長)等治療中,能刺激骨組織自身生長與重建。同時(shí)大量體外實(shí)驗(yàn)也表明,適當(dāng)?shù)膽?yīng)力載荷可以促進(jìn)骨形成性蛋白及其受體,膠原蛋白、OPN、VEGF等的表達(dá),誘導(dǎo)成骨細(xì)胞自身的分化增殖,調(diào)節(jié)其生理功能,有助于細(xì)胞基質(zhì)礦化與骨重建.研究類成骨細(xì)胞及成骨前體細(xì)胞的力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及骨細(xì)胞的生物學(xué)響應(yīng)對于口腔正畸,正頜外科,口腔種植修復(fù),牙槽骨再生,種子細(xì)胞工程學(xué)具有重要意義,但目前機(jī)械應(yīng)力刺激成骨細(xì)胞的力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及成骨細(xì)胞在力學(xué)環(huán)境中的生物學(xué)響應(yīng)有待于繼續(xù)深入. Wnt信號通路通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖、分化和功能來影響個(gè)體出生后的骨組織生長和發(fā)育。上調(diào)或下調(diào)這條途徑中各個(gè)因子的表達(dá)能夠明顯的改變成骨細(xì)胞的功能,并改變整個(gè)骨量的變化。淋巴樣增強(qiáng)因子-1(1ymphoid enhancer factor-l,LEF-1)是淋巴增強(qiáng)因子/T-細(xì)胞因子(LEF/TCF)家族的成員之一,位于人4號染色體q23-q25區(qū)域,作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子是Wnt信號通路的核心成分,屬于高遷移率組分(high mobility group,HMG)。研究顯示LEF-1參與Wnt信號通路,IL-7受體信號通路、TGF-β信號通路等多條信號通路的調(diào)控,具有復(fù)雜性及多啟動子特征,多結(jié)構(gòu)域,多異構(gòu)體的特點(diǎn)。LEF-1蛋白異常已在一些牙胚發(fā)育,骨組織發(fā)育,口腔惡性腫瘤如惡性黑色素瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并引起重視,關(guān)于其在各種屬成骨(類)細(xì)胞接受機(jī)械力學(xué)刺激后的表達(dá),目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道,通過國內(nèi)外核心期刊的文獻(xiàn)檢索,反映Wnt通路的上游研究包括目的基因的識別傳遞,膜受體的結(jié)合,介質(zhì)在胞漿的傳遞和轉(zhuǎn)移等方面涉及的研究較多,但靶基因結(jié)合后效應(yīng)階段的研究尚處于起步階段.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或骨祖干細(xì)胞不表達(dá)典型的成骨標(biāo)志基因,循環(huán)牽張力誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子FosB表達(dá)成骨標(biāo)志基因[1],并激活Wnt信號途徑促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的力敏感基因表達(dá)[2].前成骨細(xì)胞在基因Osx的調(diào)控下,分化為典型的成骨細(xì)胞,然后分化成熟,合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì),包括成熟早期的骨涎蛋白,中期的骨鈣素和晚期的骨橋蛋白[3-4].基于以上實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),本實(shí)驗(yàn)采用力學(xué)加載裝置對來源于不同種屬的成骨前體細(xì)胞:大鼠來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Marrow Mesenchymal Stem Cells,MSCs ),人牙周膜細(xì)胞( human periodontal ligament cells,hPDLC ) ,小鼠來源的MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞系進(jìn)行橫向研究,從細(xì)胞的基因水平和蛋白水平通過細(xì)胞受力前后LEF-1的表達(dá)改變,初步探討三種類成骨細(xì)胞在機(jī)械應(yīng)力作用下LEF-1的表達(dá),下游靶效應(yīng)機(jī)制以及牽張力對細(xì)胞分化增殖特性的影響,從Wnt信號通路角度探索LEF-1的生物學(xué)功能和機(jī)械應(yīng)力對于誘導(dǎo)骨轉(zhuǎn)化形成的分子生物學(xué)機(jī)制. 材料與方法: 1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的原代培養(yǎng) 全骨髓貼壁法培養(yǎng)大鼠BMSCs.處死大鼠后將大鼠雙側(cè)股骨和脛骨骨骺端剪去,PBS反復(fù)沖洗骨髓腔,收集沖洗液于離心管中,離心棄上清,加入培養(yǎng)液后吹打形成單細(xì)胞懸液,接種于培養(yǎng)瓶內(nèi),常規(guī)換液傳代. 2人牙周膜細(xì)胞的原代培養(yǎng) 收集臨床上11-14歲因正畸需要拔除的牙周健康無齲的新鮮前磨牙,拔除后立即在雙抗PBS液和DMEM液中反復(fù)清洗牙齒,刮下根中1/3牙周膜組織,不經(jīng)剪切,直接置于離心管中,加入Ⅰ型膠原酶,采用酶消化法結(jié)合組織塊混合培養(yǎng)法培養(yǎng)hPDLC.取第二代細(xì)胞經(jīng)SABC免疫細(xì)胞化學(xué)檢測證實(shí)為牙周膜成纖維細(xì)胞. 3 MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠胚胎成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)蘇后用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(內(nèi)含10% FBS),每3天換液1次,細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí),用0.25%胰酶消化,按5×105個(gè)細(xì)胞接種至25 cm培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。 4反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測加力前后三種(類)成骨細(xì)胞LEF-1的表達(dá) 1)引物設(shè)計(jì)與合成; 2)細(xì)胞總DNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄; 3)將總DNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA; 4)將cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,電泳檢測PCR擴(kuò)增物:PCR反應(yīng)結(jié)束后,在1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳,使用DL-2000 DNA Marker,所得結(jié)果拍照并掃描. 5免疫熒光雙標(biāo)記 加力完畢后用4%多聚甲醛固定, 0. 2% TritonX 100透化去交聯(lián),其間2%牛血清白蛋白封閉非特異性位點(diǎn)。每張爬片加入30μ12%牛血清白蛋白(BSA)稀釋的非磷酸化β-catenin多克隆抗體(1∶100) ,放入濕盒1h ,避光下加入30μl2% BSA稀釋的RBITC標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶150) ,放入濕盒1h。DAPI作用5 min ,將玻片反扣于新玻片,中間加MOVO(熒光淬滅劑) 10 ml,95%甘油封片。熒光倒置顯微鏡下分別在495 nm,527 nm激發(fā)光下觀察同一視野中的表達(dá)情況并攝像。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。每個(gè)水平每張照片選取3個(gè)不同的視野,每個(gè)視野50個(gè)細(xì)胞,用Image2pro2plus圖像分析軟件分析各個(gè)水平蛋白表達(dá)的積分光密度值(IOD). 6 ALP染色 將細(xì)胞以1×10~8/ml接種于玻片→PBS清洗蓋玻片3次→10%甲醛溶液中固定30min→蒸餾水漂洗5 min→放入孵育液、37℃孵育2h→蒸餾水漂洗5min→2%硝酸鉆液作用2min→蒸餾水漂洗5min→2%硫化胺液作用2min→蒸餾水漂洗多余的硫化胺染液,待干→2%美藍(lán)復(fù)染→樹膠封存后置于光學(xué)顯微鏡觀察。 7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用Bandscan5.0對結(jié)果進(jìn)行灰度值分析.以樣品的LEF-1的灰度值與同一樣品GAPDH的灰度值之比作為評價(jià)LEF-1的指標(biāo).(t檢驗(yàn)) 結(jié)果 RT-PCR檢測表明,來源于不同種屬的細(xì)胞MSCs細(xì)胞,hPDLC細(xì)胞,MC3T3細(xì)胞內(nèi)存在LEF-1 mRNA表達(dá);在FSS作用下LEF-1 mRNA表達(dá)水平的升高具有規(guī)律性,但存在一定差異. 在人牙周膜細(xì)胞組,對照組LEF-1 mRNA表達(dá)微弱。加力2h,4h后,LEF-1 mRNA表達(dá)水平呈升高趨勢,加力8h LEF-1 mRNA表達(dá)水平升高至峰值,12h LEF-1 mRNA表達(dá)水平開始下降,但仍高于對照組;在MSCs細(xì)胞組對照組和2h LEF-1 mRNA表達(dá)微弱,4h組未見表達(dá),8h組LEF-1 mRNA表達(dá)水平升高至峰值;在MC3T3-E1細(xì)胞組,對照組和2h組的LEF-1 mRNA有較弱表達(dá),半小時(shí)和4h組LEF-1 mRNA表達(dá)下降,持續(xù)12dyn/cm 8h組的LEF-1 mRNA表達(dá)水平升高至峰值. 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LEF-1 mRNA在正常人牙周膜細(xì)胞的表達(dá)(未見報(bào)告).在FSS作用的12 h內(nèi),MSCs細(xì)胞,hPDLC細(xì)胞,MC3T3細(xì)胞內(nèi)的LEF-1 mRNA表達(dá)呈波動增強(qiáng)趨勢,且在不同大小的FSS力值,不同種屬來源前提下均于8h到達(dá)LEF-1 mRNA表達(dá)峰值,該結(jié)果表明剪切應(yīng)力增強(qiáng)LEF-1的表達(dá),我們認(rèn)為LEF-1 mRNA的表達(dá)增強(qiáng)是類成骨細(xì)胞經(jīng)典Wnt信號通路對剪切應(yīng)力的應(yīng)答反應(yīng). LEF-1蛋白的低表達(dá)是成骨細(xì)胞成熟的必要條件.LEF-1的表達(dá)未見種屬差異.
【圖文】：

本實(shí)驗(yàn)梯度離心結(jié)果為:從上到下依次為血小板層,白膜層,Percoll,紅細(xì)胞層.其中白膜層為 MSCs 層,是一個(gè)單個(gè)核細(xì)胞層.結(jié)合利用SCs 的貼壁生長特性,棄去未貼壁細(xì)胞,獲得比例更大,均一性更高的大 MSCs.倒置顯微鏡下觀察: 48-72h 貼壁細(xì)胞多數(shù)呈纖維狀,換液除去未貼細(xì)胞.接種 5-7 天形成集落,14 天達(dá)到融合 85%.傳代培養(yǎng)后觀察:均勻布生長,細(xì)胞絕大部分呈長梭形,少數(shù)為三角形,胞核呈圓形或橢圓形,于細(xì)胞中央,為藍(lán)色,可見數(shù)個(gè)深藍(lán)色的核仁,胞漿為淡紅色,染色質(zhì)疏.鑒定:本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化方法檢測了大鼠 MSCs 的 4 種表面抗原的達(dá)情況.結(jié)果顯示:CD34(造血干細(xì)胞標(biāo)記物)陰性,排除了細(xì)胞是造血細(xì)胞的可能;CD44 陽性,ColagenⅠ陰性,Fibronectin 陽性說明了培養(yǎng)大鼠細(xì)胞是 MSCs.(圖 1,2)

本實(shí)驗(yàn)梯度離心結(jié)果為:從上到下依次為血小板層,白膜層,Percoll,紅細(xì)胞層.其中白膜層為 MSCs 層,是一個(gè)單個(gè)核細(xì)胞層.結(jié)合利用SCs 的貼壁生長特性,棄去未貼壁細(xì)胞,獲得比例更大,均一性更高的大 MSCs.倒置顯微鏡下觀察: 48-72h 貼壁細(xì)胞多數(shù)呈纖維狀,換液除去未貼細(xì)胞.接種 5-7 天形成集落,14 天達(dá)到融合 85%.傳代培養(yǎng)后觀察:均勻布生長,細(xì)胞絕大部分呈長梭形,少數(shù)為三角形,胞核呈圓形或橢圓形,于細(xì)胞中央,為藍(lán)色,可見數(shù)個(gè)深藍(lán)色的核仁,胞漿為淡紅色,染色質(zhì)疏.鑒定:本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化方法檢測了大鼠 MSCs 的 4 種表面抗原的達(dá)情況.結(jié)果顯示:CD34(造血干細(xì)胞標(biāo)記物)陰性,排除了細(xì)胞是造血細(xì)胞的可能;CD44 陽性,ColagenⅠ陰性,Fibronectin 陽性說明了培養(yǎng)大鼠細(xì)胞是 MSCs.(圖 1,2)
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R783.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2619012