【摘要】： 腭裂是一種常見的先天性畸形,因其影響因素十分復(fù)雜,發(fā)生機(jī)制目前仍未明確。近年來一些研究表明,腭中嵴上皮細(xì)胞(MEE)、腭突間充質(zhì)細(xì)胞(EPM)以及舌體細(xì)胞的增殖和凋亡對腭的正常發(fā)育具有重要作用,與腭裂的形成密切相關(guān)。Wnt5a是Wnt信號分子家族中唯一在上皮和間充質(zhì)中均有表達(dá)的成員,并且經(jīng)由Wnt/Ca2+信號通路在胚胎的發(fā)育過程中起到調(diào)控作用。以往的研究證實(shí)Wnt5a基因敲除小鼠全部外向型生長的組織,包括上下頜骨、四肢、尾以及生殖器等均發(fā)育不良,并且存在初級胚胎A-P體軸延展不足。其機(jī)制主要是Wnt5a基因敲除導(dǎo)致進(jìn)展區(qū)細(xì)胞增殖水平的下降。目前,國內(nèi)外尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道Wnt家族成員的Wnt5a基因敲除小鼠口腔頜面部尤其是腭部的發(fā)育異常。 本實(shí)驗(yàn)對Wnt5a基因敲除小鼠胚胎頜面部進(jìn)行冠狀面連續(xù)切片,觀察其繼發(fā)腭的形態(tài);利用BrdU標(biāo)識法和TUNEL染色,研究側(cè)腭突細(xì)胞以及舌體細(xì)胞在腭突融合期的細(xì)胞增殖和凋亡水平,來探索Wnt5a基因敲除小鼠腭裂發(fā)生的機(jī)制。 目的:本課題應(yīng)用Wnt5a基因敲除小鼠,通過觀察細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡在腭部發(fā)育和腭裂發(fā)生中表達(dá)水平和分布的改變,探究Wnt5a信號分子對頜面部尤其是腭部發(fā)育的調(diào)控機(jī)制。 方法:本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的Wnt5a基因敲除雜合子成鼠由美國Harvard大學(xué)的Dr. McMahon實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予,飼養(yǎng)在美國南加州大學(xué)Keck醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心,將陰栓陽性的孕鼠記為妊娠0天(gestation day 0,GD0)全部孕鼠分別于GD14、GD15和GD18上午10時(shí)處死,處死前20分鐘均按100mg/kg體重腹腔注射BrdU。分離Wnt5a基因敲除和正常對照鼠胚,4%多聚甲醛固定,系列脫水,包埋,5μm冠狀面連續(xù)切片用于HE染色、BrdU標(biāo)識和TUNEL標(biāo)記。 結(jié)果:與正常對照組相比,Wnt5a基因敲除小鼠胚胎表現(xiàn)如下:1、口腔頜面部形態(tài)學(xué)上的明顯異常,主要為上下頜短縮、舌異常隆起并且未能下降、側(cè)腭突短縮并缺乏水平上抬而形成腭裂。2、BrdU染色結(jié)果顯示腭突融合期的腭間充質(zhì)細(xì)胞以及舌上皮與間充質(zhì)細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)和陽性細(xì)胞率與正常對照組相比無顯著性差異,而在腭正中嵴上皮卻未發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞。3、TUNEL標(biāo)識法結(jié)果顯示腭突間充質(zhì)細(xì)胞、舌背上皮細(xì)胞及舌體間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)生異常增多的TUNEL陽性的凋亡細(xì)胞,而在腭正中嵴上皮卻未發(fā)現(xiàn)TUNEL陽性細(xì)胞。 結(jié)論:1、Wnt5a基因敲除小鼠口腔頜面部發(fā)育異常,主要表現(xiàn)為腭裂和舌形態(tài)及位置異常。2、Wnt5a基因敲除小鼠腭裂發(fā)生與腭正中嵴上皮細(xì)胞的增殖和凋亡水平改變以及腭突間充質(zhì)細(xì)胞凋亡水平改變具有相關(guān)性;同時(shí)舌形態(tài)及位置異常也是其腭裂發(fā)生的重要影響因素。
【圖文】：

光學(xué)顯微鏡觀察 Wnt5a 基因敲除小鼠胚胎口腔頜面部冠14.5、HE 染色）對照組：舌體表面已經(jīng)轉(zhuǎn)變至扁平，并且下降至相當(dāng)于前腭突生長良好（A）；側(cè)腭突前 1/3 部（下頜第一磨牙照）的雙側(cè)側(cè)腭突已經(jīng)上抬至舌體上方，并且在中線處可見少量殘余 MEE 細(xì)胞，左右兩側(cè)腭突的 EPM 細(xì)胞已（B）；側(cè)腭突后 1/3 部（上頜第一磨牙牙胚作為平面參突處于接觸融合的初期，中線處可見若干殘留 MEE 細(xì)胞驗(yàn)組：舌體形態(tài)依舊處于高而窄的狀態(tài)，舌表面凹凸不稍有下降，但依然占據(jù)了固有口腔的大部分空間。前腭常（D）；側(cè)腭突前 1/3 部的左右兩側(cè)腭突已上抬至舌的行水平方向的生長，但是沒有發(fā)生接觸，即該部位發(fā)生E）；側(cè)腭突后 1/3 部的左右兩側(cè)腭突在舌的兩側(cè)進(jìn)行垂裂隙的距離大于側(cè)腭突前部（F）。（A、B、C 為正常對照

光學(xué)顯微鏡觀察 BrdU 陽性細(xì)胞在口腔頜面部的表達(dá)分布U 陽性細(xì)胞表現(xiàn)為胞核的褐色染色。低倍視野可見陽性細(xì)頜、下頜、牙胚、腭突以及舌組織(A、D)；Wnt5a 基因以及側(cè)腭突間充質(zhì)的 BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)量以及占總細(xì)胞組相比無顯著差異（B、E）。正常對照組側(cè)腭突融合，皮細(xì)胞仍可見 BrdU 陽性細(xì)胞（C）；Wnt5a 基因敲除小發(fā)生接觸融合，其正中嵴上皮細(xì)胞已由復(fù)層轉(zhuǎn)化為單層胞核明顯，但未見 BrdU 陽性細(xì)胞（F）。（A、B、C 為正E、F 為基因敲除組；A、D 為 25 倍放大，，B、E 為 100 200 倍放大； T 為舌； D 為牙胚； P 為側(cè)腭突；黑色箭頭 MEE 中 BrdU 陽性細(xì)胞；紅色箭頭所指為基因敲除小平狀細(xì)胞）
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R782.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2612448