【摘要】： 目的: 本研究觀測煙草浸提液(smokeless tobacco extract,ST)和尼古丁(nicotine)對人牙齦成纖維細(xì)胞(Human Gingival Fibroblasts,HGFs)在鈦板上附著數(shù)目、形態(tài)、增殖及分泌膠原的影響,從細(xì)胞水平探討煙草對種植體齦界面破壞的理論機(jī)制。 方法: 實驗1、采用組織塊法進(jìn)行HGFs的原代培養(yǎng),倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。取第3代HGFs用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(streptavidin-perosidase,SP)進(jìn)行波形絲蛋白(cytokeratin,CK)和角蛋白(vimentin,V)染色以鑒定細(xì)胞來源,用血球計數(shù)板計數(shù)法記錄細(xì)胞的生長曲線。 實驗2、將厚度1mm、直徑10mm的鈦板用金相砂紙逐級打磨。反射光顯微鏡、掃描電鏡觀測鈦板表面形態(tài)。表面粗糙度測量儀測量鈦板表面粗糙度,以Ra值表征。 實驗3、將消毒備用的鈦板置于24孔板中,加入含0、0.01、0.1、1、5、10g/L ST和0.03、0.15、0.3g/L尼古丁(9種濃度)的細(xì)胞懸浮液。孵育2小時后,MTT法測定鈦板表面粘附細(xì)胞數(shù);孵育24小時后,計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測定鈦板表面細(xì)胞鋪展形態(tài)的變化。 不含處理因素的細(xì)胞懸浮液接種于預(yù)先放置在24孔板內(nèi)的鈦板表面,孵育24小時后,更換含0、0.01、0.1、1、10g/L ST和0.03g/L尼古丁(6種濃度)的培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng),在第1、4、7、10天行MTT法測定細(xì)胞增殖率。 實驗4、取細(xì)胞懸浮液接種于24孔板內(nèi)鈦板表面,孵育24小時后,更換含0、0.01、0.1、1、5、10、25g/L ST和0.03、0.15、0.3g/L尼古丁(10種濃度)的培養(yǎng)液。繼續(xù)孵育48小時后,吸取出24孔板內(nèi)的培養(yǎng)液,檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸含量。 結(jié)果: 1、HGFs最早在第3d從組織塊中爬出,大多呈梭形。一般2～3周長滿瓶底,可進(jìn)行傳代。SP免疫組化染色結(jié)果顯示HGFs波形絲蛋白染色為陽性,角蛋白染色為陰性,提示該細(xì)胞來源于中胚層,非上皮來源性細(xì)胞。HGFs生長曲線略呈“S”形,接種后第1天細(xì)胞數(shù)略有下降,隨后生長逐漸加快,這種狀態(tài)持續(xù)至第5d。第6d開始進(jìn)入平臺期,細(xì)胞生長速度減緩。 2、打磨后的鈦板表面呈規(guī)則溝嵴相間的表面形貌,其表面粗糙度測量Ra值為0.1022±0.00766μm。 3、MTT法測2小時鈦板表面粘附細(xì)胞數(shù)表明,ST和尼古丁均可抑制牙齦成纖維細(xì)胞在鈦板表面的附著,且抑制作用隨著ST或尼古丁濃度的增加而增強(qiáng)�？刂平M(0g/L ST)與0.01、0.1、1g/L ST 0.03g/L尼古丁組比較,統(tǒng)計分析差異無顯著性(P＞0.05)。而控制組與5、10、25g/L ST和0.15、0.3g/L尼古丁組比較時,統(tǒng)計分析差異有顯著性(P＜0.05)。 HGFs在鈦板表面粘附24小時后,表現(xiàn)為扁平的紡錘形,沿著劃痕方向伸展。ST和尼古丁均可抑制HGFs在鈦板表面的伸展,且隨著ST或尼古丁濃度的增加,細(xì)胞伸展面積逐漸減小,形態(tài)逐漸變?yōu)閳A形。 MTT法測1d、4d、7d、10d細(xì)胞在鈦板表面的增殖結(jié)果表明,ST或尼古丁可抑制HGFs在鈦板表面的增殖,且抑制的強(qiáng)弱與劑量相關(guān)。當(dāng)ST的濃度為10 g/L時,細(xì)胞的增殖完全被抑制。 4、ST和尼古丁可抑制HGFs膠原的合成,且抑制的強(qiáng)弱與ST和尼古丁的劑量相關(guān)。 結(jié)論: 1、牙齦成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)成功率較高,可為本實驗的研究提供足夠的細(xì)胞。 2、處理后的鈦板表面呈現(xiàn)規(guī)則的形貌,粗糙度在臨床常用種植體基樁表面粗糙度的范圍內(nèi),適于細(xì)胞附著。 3、ST和尼古丁均可抑制HGFs在鈦板表面的粘附、形態(tài)伸展及其增殖,且抑制強(qiáng)弱與劑量呈正相關(guān)。 4、ST和尼古丁均可抑制鈦板上HGFs膠原合成,且抑制強(qiáng)弱與劑量呈正相關(guān)。
【圖文】：

單因素方差分析結(jié)果顯示:各處理組間吸光度均數(shù)差異有顯著性PsT<0.01;F尼古丁=23.504，P尼古丁<0.01)。陰性組與ST組之間兩兩比0.01、0.1、19/LST組吸光度均數(shù)比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);59/LST組之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);而陰性組與59/LS組與59/LST組，109/LST組與19/LST組，109/LST組與0.19/LST組與0.019/LST組吸光度均數(shù)各不相同，分別有統(tǒng)計學(xué)意義(P陰性組與尼古丁組之間兩兩比較:陰性組、0.039/L尼古丁組較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);陰性組與0.159/L尼古丁組，陰性組古丁組分別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3、ST對人牙跟成纖維細(xì)胞在欽板表面貼附形態(tài)的影響在熒光顯微鏡下，，放大倍數(shù)為100一200倍時，欽板表面不顯像，

濱州醫(yī)學(xué)院碩士論文量逐漸減少(附圖17~19)。在5克/升ST時可見壞死裂解的細(xì)胞(附圖20)。從表2、圖2可見，牙跟成纖維細(xì)胞在欽板表面的鋪展受到煙草浸提液和尼古丁的抑制。單因素方差分析結(jié)果顯示:各處理組間鋪展面積均數(shù)差異有顯著性(FsT=42.962，Ps丁<0.01;F尼古T=85.779，P尼古T<0.01)。陰性組與ST組之間兩兩比較:陰性組與各ST組鋪展面積均數(shù)比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05):0.01與0.19/L組，5與109/L組分別比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);19/L組與0.01、0.1、5、109/L組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。陰性組與尼古丁組之間兩兩比較:陰性組與0.03、0.15、0.39/L組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);尼古丁0.039/L組與0.15、0.39/L組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);0.巧與0.39/L組之間無明顯差異(P>0.05)。表2不同濃度ST和尼古丁對HGFs在欽板表面24小時鋪展的影響分組面積x士s單位:對形狀系數(shù)Sf陰性 09/LST 0.019/LST34421.31士8331.49 1.0677士0.2678 21902.63士5757.61 0.9107士0.2153 0.19/LST19/LST59/LST 109/LST19855.13士8081.42 0.7915士0.179113914.06士2568.10 0.7676士0.20769337.85士1785.36 0.3797士0.15296949.03士2129.79 0.7173士 0.31730.039/L尼古丁0.159/L尼古丁0.39/L尼古丁26296.42士4238.05 0.7903士0.166410209.56士3837.82 0.9398士0.17636470.83士1986，55 0.8104士O，2126400003500030000250002000015000100005000
【學(xué)位授予單位】：濱州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2604247