【摘要】：牙周病可導(dǎo)致牙周支持組織的破壞，例如牙槽骨的急性或慢性吸收，進(jìn)而牙齒脫落，最終形成牙周缺損。因此，牙槽骨的再生，成為了臨床醫(yī)生修復(fù)牙周缺損的重要目標(biāo)。 過去二十年中臨床應(yīng)用各種方法包括外科手術(shù)、咬合屏障膜、骨移植、骨傳導(dǎo)生物材料等修復(fù)牙周缺損，均未取得理想的效果。隨著細(xì)胞膜片技術(shù)的快速發(fā)展，細(xì)胞膜片已成為組織工程研究的熱點(diǎn)之一。該技術(shù)也為牙周缺損的修復(fù)帶來了新的活力和生機(jī)。 牙囊組織含有形成牙周膜、牙骨質(zhì)、牙槽骨的前體細(xì)胞，這些前體細(xì)胞在特定條件的誘導(dǎo)下可分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，具有很強(qiáng)的干細(xì)胞特性，統(tǒng)稱為牙囊干細(xì)胞（DFSCs）。而隨著智齒阻生發(fā)病率的升高，拔除的帶有牙囊組織的智齒為我們提供了豐富的DFSCs來源。 目的：從比格犬尖牙牙胚中分離出牙囊干細(xì)胞（Dental Follicle Stem Cells,DFSCs），對其進(jìn)行形態(tài)觀察，干細(xì)胞鑒定、增值和分化能力檢測，并以犬的牙囊細(xì)胞作為種子細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞膜片，并對該膜片的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。 方法：從4至6月齡犬離體尖牙分離牙胚，膠原酶消化，獲得牙囊細(xì)胞，體外培養(yǎng)取第3代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞克隆形成、細(xì)胞流式鑒定等。然后用含抗壞血酸的培養(yǎng)基誘導(dǎo)2周構(gòu)建細(xì)胞膜片。構(gòu)建成功后，通過倒置顯微鏡、HE染色、掃描電鏡(SEM)對牙囊細(xì)胞膜片進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測。于細(xì)胞膜片構(gòu)建10天時(shí)，對細(xì)胞膜片分別進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)，連續(xù)誘導(dǎo)2周，行茜素紅染色及油紅O染色，鏡下觀察成骨、成脂情況。 結(jié)果：DFSCs在體外被成功分離、純化、培養(yǎng)，細(xì)胞克隆形成率約為5.1%。細(xì)胞流式鑒定為CD29（+）、CD44（+）、CD34（-）。MTT顯示DFSCs增殖能力較強(qiáng)。細(xì)胞周期檢測結(jié)果為：G1=87.1%，G2=5.54%。牙囊細(xì)胞成膜誘導(dǎo)2周后，獲得白色膜狀細(xì)胞膜片。HE染色顯示該膜片由2～4層細(xì)胞組成，掃描電鏡(SEM)示細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞基質(zhì)分泌多。細(xì)胞膜片成脂誘導(dǎo)14天，經(jīng)油紅O染色后，鏡下可見大量脂滴形成；細(xì)胞膜片成骨誘導(dǎo)14天，，經(jīng)茜素紅染色后鏡下可見大量清晰的鈣結(jié)節(jié)形成。 結(jié)論：本研究我們已成功探索出比格犬牙囊細(xì)胞膜片構(gòu)建方法，并證明其具有很強(qiáng)的成骨能力。為進(jìn)一步應(yīng)用犬DFSCs細(xì)胞膜片修復(fù)牙槽骨缺損的研究提供前期的準(zhǔn)備和條件。
【圖文】：

圖 1 DFSCs體外分離培養(yǎng):(A)原代DFSCs24h完全貼壁并伸展(B)第3代得到純化的DFSCs。s preparation:(A)Primary passage DFSCs adhered and spreave been purified at the 3rd passage.MTT assay00.050.10.150.20.251 2 3 4 5 6 7 8Time(d)MTT(OD)DF驗(yàn)結(jié)果：生長曲線呈S形。橫坐標(biāo)為天數(shù)(d)，縱坐標(biāo)為光密

圖 3 DFSCs細(xì)胞周期檢測結(jié)果：G1=87.1%, G2=5.54%, S=7.32%。Fig 3 Representative DFSCs cell-cycle distribution：G1=87.1%, G2=5.54%, S=7.32%.圖 4 克隆形成：(A) 培養(yǎng)14天后細(xì)胞個(gè)數(shù)超過50個(gè)的細(xì)胞集落.(B) 每個(gè)培養(yǎng)皿上形成的細(xì)胞集落數(shù)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R781.4

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2 李銳,李振鋼,楊富生;牙囊在牙齒萌出時(shí)的調(diào)控作用[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2000年02期

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