【摘要】：寡脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)是一種堿基數(shù)目通常少于五十個的脫氧核苷酸序列,存在于自然界某些低等生物基因組的DNA中,易于與它們的互補鏈相互對接。MT01是依據(jù)人線粒體DNA人工設計合成的含有27個堿基的特定序列ODN,通過胞吞作用進入細胞,可與Toll樣受體9(Toll like receptor 9,TLR9)和Toll樣受體7(Toll like receptor 7,TLR7)結(jié)合,增強人和大鼠成骨細胞內(nèi)成骨標志性基因如Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、Ⅰ型膠原(Collagen-Ⅰ,COL-Ⅰ)和骨保護素(osteoprotegerin,OPG)等在mRNA水平的表達,從而促進成骨細胞的分化,但MT01易于被核酸酶降解且其表面的負電荷與細胞膜表面的負電荷存在靜電排斥影響細胞攝取率,故有研究使用對MT01進行硫代修飾形成的MT01-S,雖然可以在一定程度上阻斷細胞內(nèi)的核酸酶對MT01的降解,但可能對機體造成一系列不良反應,因此本實驗欲研究新型載體PEN可否用于裝載游離的MT01使其更好地發(fā)揮效用。目的:本實驗通過構建PEN/MT01復合物,檢測其對BMSCs細胞增殖及細胞內(nèi)成骨相關基因ALP、Runx2及COL-Ⅰ表達的影響,探討PEN能否成為MT01的有效載體協(xié)同影響大鼠BMSCs的細胞增殖及分化過程。方法:首先,通過靜電裝載方式制備出PEN與MT01不同質(zhì)量比例的7種混合物,即PEN與 MT01 的質(zhì)量比例分別為:0.5:1、1:1、2:1、4:1、6:1、8:1 和 10:1,形成7種不同的PEN/MT01復合物后對大鼠BMSCs進行細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染,檢測BMSCs的細胞增值率,通過與單純的PEN載體組以及空白對照組進行對比,篩選出需要進一步研究的PEN/MT01復合物的最佳質(zhì)量比例。然后,分別設置游離的MT01組、MT01-S組和空白對照組,與篩選出的最佳質(zhì)量比例的PEN/MT01復合物組進行對照,檢測BMSCs細胞內(nèi)ALP、Runx2及COL-Ⅰ的表達水平,評估該復合物是否對大鼠BMSCs的分化有影響。實驗一:MTT比色法檢測PEN/MT01復合物作用下BMSCs的細胞增殖率,目的是篩選出PEN與MT01的最佳裝載質(zhì)量比例;實驗二:通過堿性磷酸酶試劑盒檢測篩選出的PEN/MT01復合物對BMSCs細胞內(nèi)成骨分化相關蛋白堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影響;實驗三:通過Real time-PCR法檢測篩選出的PEN/MT01復合物對BMSCs細胞內(nèi)成骨標志性基因Runx2和Collagen-Ⅰ在基因表達水平的影響;實驗四:通過堿性磷酸酶染色,觀察篩選出的PEN/MT01復合物對BMSCs體外成骨分化的影響;結(jié)果:BMSCs細胞增殖率檢測結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染后第1天,PEN與MT01的質(zhì)量比例為2:1的PEN/MT01復合物對BMSCs的細胞存活率影響最小,并且隨時間的延長至轉(zhuǎn)染后的第2天、第3天,PEN與MT01的質(zhì)量比例為2:1的PEN/MT01復合物組BMSCs的細胞增值率均最高(p0.01),提示該比例復合物對BMSCs的細胞增殖有最佳促進作用,故篩選得出的PEN與MT01靜電裝載的最佳質(zhì)量比例為2:1。BMSCs細胞內(nèi)堿性磷酸酶活性檢測實驗中發(fā)現(xiàn),在游離的MT01組、MT01-S組、2:1的PEN/MT01復合物組、6:1的PEN/MT01復合物組以及空白對照組中,在所檢測的三個時間點即第1天、第3天和第5天,2:1的PEN/MT01復合物組BMSCs細胞內(nèi)堿性磷酸酶活性的表達均最高(p0.01),優(yōu)于MT01-S組及其他各組。BMSCs細胞內(nèi)成骨標志性基因的Realtime-PCR檢測實驗表明,在游離的MT01組、MT01-S組、2:1的PEN/MT01復合物組以及空白對照組中,與空白對照組相比,其他三個組BMSCs細胞內(nèi)成骨標志性基因Runx2和Collagen-Ⅰ的表達均有升高。其中,從成骨相關基因Runx2的檢測結(jié)果來看,在第3天時,MT01-S組Runx2的表達高于其他三組,隨時間的延長到轉(zhuǎn)染后第5天,2:1的PEN/MT01復合物組Runx2表達顯著升高(p0.01),明顯高于其他組,基因表達顯著的優(yōu)勢持續(xù)到轉(zhuǎn)染后的第7天;從成骨相關基因Collagen-Ⅰ的檢測結(jié)果來看,在第3天、第5天、第7天三個時間點,都是PEN和MT01的質(zhì)量比例為2:1的PEN/MT01復合物組基因表達水平最高(p0.01),均優(yōu)于其他組。堿性磷酸酶染色發(fā)現(xiàn),PEN和MT01的質(zhì)量比例為2:1的PEN/MT01復合物組堿性磷酸酶染色的顏色最深,其次分別是MT01-S組、游離的MT01組和空白對照組。結(jié)論:PEN可以用來做為一種載體去搭載MT01,能有效提高游離的MT01被細胞內(nèi)吞的效率,PEN與MT01以不同質(zhì)量比例裝載形成的PEN/MT01復合物均可對骨髓間充質(zhì)干細胞的細胞增殖產(chǎn)生影響,當PEN與MT01質(zhì)量裝載比例達到6:1時,細胞毒性開始逐漸顯現(xiàn),隨著PEN/MT01復合物內(nèi)PEN所占質(zhì)量比例的增大,PEN/MT01復合物對BMSCs的細胞毒性也逐漸增大,當PEN與MT01的質(zhì)量裝載比例為2:1時大鼠BMSCs的細胞存活率最高,并且隨時間的延長該比例的復合物對BMSCs的細胞增殖過程有最佳促進作用,故選取PEN與MT01質(zhì)量比例為2:1的PEN/MT01復合物,研究其能否對BMSCs的成骨分化產(chǎn)生影響;本實驗發(fā)現(xiàn)篩選出的2:1的PEN/MT01復合物可以增強BMSCs細胞內(nèi)堿性磷酸酶在蛋白水平與骨改建相關因子Runx2和Collagen-Ⅰ在基因水平的表達,并且其增強效果優(yōu)于MT01-S組、游離的MT01組以及空白對照組。
【圖文】：

，。－良好，貼壁較均勻，倒置顯微鏡觀察活體細胞形態(tài)：呈纖維狀梭形有突起－１０ｄ時，細胞匯合成片其融合率可達到８０％，細胞多呈長梭形，且排列具性，可進行第一次傳代培養(yǎng)，此后通過貼壁差異ＢＭＳＣｓ可在傳代中逐漸得，傳至第三代時細胞多呈長梭形，且排列具有方向性，生長狀態(tài)良好（圖２．邋１））邐ＢＭＳＣｓ的細胞接種：逡逑待上述細胞生長至第二代，其融合度為８０％－９０％，無菌ＰＢＳ沖洗２次，，２．５ｇ／白酶消化ｌ－２／ｎｉｎ，使用完全培養(yǎng)基終止細胞消化過程，轉(zhuǎn)移入離心管離００邋ｒｐｍ，５ｍｉｎ）。離心后用完全培養(yǎng)基吹打均勻，重懸細胞，以每孔５０００于９６孔板內(nèi)或以每孔１＞＜１０５個接種于６孔板內(nèi)，為避免邊緣效應的產(chǎn)生，６孔板周圍各孔加入２００ｕｌ無菌ＰＢＳ進行封閉，最后將培養(yǎng)板置于３７°Ｃ、５％Ｃ０Ｉｄ，靜待細胞貼壁。逡逑

第３章結(jié)果逡逑３．１邋ＰＥＮ／ＭＴ０１復合物對ＢＭＳＣｓ細胞增殖的影響逡逑如圖３．１所示，在不同質(zhì)量比例ＰＥＮ／ＭＴ０１復合物轉(zhuǎn)染ＢＭＳＣｓ邋２４ｈ后，與空逡逑白對照組相比，實驗中設置的７個復合物實驗組及單純載體組對ＢＭＳＣｓ的細胞增逡逑值均有抑制作用，當ＰＥＮ與ＭＴ０１質(zhì)量比例小于６：１時，組間差異不是很明顯，逡逑當ＰＥＮ與ＭＴ０１質(zhì)量比例達到６：１時，細胞毒性開始較明顯地逐漸顯現(xiàn)，ＢＭＳＣｓ逡逑的細胞存活率逐漸下降，當ＰＥＮ與ＭＴ０１質(zhì)量比例達到１０：１時，ＰＥＮ／ＭＴ０１復合逡逑物對ＢＭＳＣｓ的細胞毒性達到最大（Ｐ＜０．邋０１）邋（＊表示Ｐ＜０．邋０５，即有顯著性的差逡逑異；＊＊表示Ｐ＜０．０１，即有非常顯著性的差異）。逡逑ＭＴＴ邋Ｄａｙ１逡逑０．４－１逡逑＿＿＿＿＿逡逑圖３．邋１不同質(zhì)量比例ＰＥＮ／ＭＴ０１復合物轉(zhuǎn)染ＢＭＳＣｓ邋２４ｈ后細胞增殖率逡逑如圖３．２所示，在不同質(zhì)量比例ＰＥＮ／ＭＴ０１復合物轉(zhuǎn)染ＭＳＣｓ４８ｈ后，當ＰＥＮ與逡逑ＭＴ０１質(zhì)量比例低于４：邋１時
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R78

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本文編號：2594440