【摘要】：研究背景 伴放線放線桿菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans,Aa)是近年來牙周炎細(xì)菌病因?qū)W研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn),是一種公認(rèn)的牙周致病菌,特別是與侵襲性牙周炎關(guān)系密切。Aa以生物膜形式寄居在人類口腔中,在生長(zhǎng)期間排出許多膜泡,內(nèi)含內(nèi)毒素、白細(xì)胞毒素和骨吸收因子等毒性因子。其產(chǎn)生的內(nèi)毒素及以白細(xì)胞毒素(leukotoxin, LT)為代表的細(xì)胞致死膨脹毒素(cytolethal distending toxin,CDT)等可溶性介質(zhì)能夠降低宿主抵抗力,導(dǎo)致牙周組織的迅速破壞,在牙周炎的發(fā)生與發(fā)展過程中起重要作用。 磷脂酰膽堿(phosphorylcholine, PC)是動(dòng)植物細(xì)胞的必需組分,富含于神經(jīng)組織,特別是髓鞘和蛋黃中。研究發(fā)現(xiàn)PC存在于多種病原菌中,包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌。目前的研究表明PC可能是病原菌的重要致病因子。 目前,磷脂酰膽堿在大部分病原菌的致病機(jī)制中的作用尚不清楚。通過對(duì)肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌等的研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌細(xì)胞壁的膽堿成分通過與內(nèi)皮細(xì)胞表面的血小板活化因子受體(Platelet activating factor-receptor, PAFR)結(jié)合來介導(dǎo)侵襲。PAFR分布于多種內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞表面,PAFR的天然配體血小板活化因子(Platelet activating factor, PAF)含有磷脂酰膽堿,細(xì)菌細(xì)胞壁中的磷脂酰膽堿可通過模擬血小板活化因子,與血小板活化因子受體結(jié)合而幫助細(xì)菌侵入宿主細(xì)胞。 以往的研究發(fā)現(xiàn)在口腔齦上和齦下菌斑中大多數(shù)的細(xì)菌可以表達(dá)PC,如口腔鏈球菌、具梭核桿菌、伴放線放線桿菌、各種放線菌屬及奈瑟菌屬等。Schenkein等人發(fā)現(xiàn)攜帶PC的Aa菌株與不攜帶PC的Aa菌株致病力有明顯差異。提示PC可能是Aa導(dǎo)致牙周病發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要的致病因子。然而,目前對(duì)于Aa細(xì)菌株上含有的磷脂酰膽堿通過哪些信號(hào)通路來介導(dǎo)了Aa對(duì)宿主細(xì)胞的黏附侵襲尚未見有人報(bào)道。本課題擬通過分離臨床Aa菌株,篩選出PC陽(yáng)性的Aa菌株,探討PC介導(dǎo)Aa黏附侵襲宿主細(xì)胞的可能機(jī)制,為研究Aa的致病機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。 一、PC陽(yáng)性的Aa菌株的分離及鑒定 采集侵襲性牙周炎患者的牙周袋內(nèi)的非附著性菌斑,接種于選擇性培養(yǎng)基TSBV平板上,觀察菌落的形態(tài)挑選可疑菌落,根據(jù)觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性、革蘭染色實(shí)驗(yàn)陰性及16SrDNA鑒定,篩選出伴放線放線桿菌臨床分離株7株。將所得的臨床菌株全細(xì)胞進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,考馬斯亮藍(lán)染色后觀察細(xì)菌蛋白的表達(dá)。并采用蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)細(xì)菌表面蛋白對(duì)磷脂酰膽堿單克隆抗體TEPC-15的反應(yīng)情況,最終篩選出磷脂酰膽堿陽(yáng)性表達(dá)的Aa菌株1株。 二、PAFR在PC陽(yáng)性Aa菌株致病過程中的作用研究 1、PC對(duì)細(xì)菌黏附和侵襲的影響 為了研究PC的表達(dá)在Aa黏附和侵襲人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)過程中的作用,我們采用抗PC的特異性單克隆抗體TEPC-15抗體預(yù)處理HUVEC30min后,分別與PC陽(yáng)性和陰性的Aa臨床分離株在37℃共孵育4h后,觀察細(xì)菌的對(duì)HUVEC的黏附和侵襲情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PC陽(yáng)性的Aa臨床分離株的黏附力和侵襲力均發(fā)生了顯著下降(P0.05),分別為對(duì)照組的31.87±4.22%和24.63±3.55%。而用TEPC-15抗體預(yù)處理細(xì)胞以后,PC陰性的Aa對(duì)HUVEC的黏附力和侵襲力則無(wú)顯著差異(P0.05)。 2、PAFR對(duì)細(xì)菌黏附侵襲的影響 為了研究PAFR是否參與了Aa對(duì)HUVEC的黏附和侵襲過程,我們利用PAFR拮抗劑(CV3988)和抗PAFR抗體作用于HUVEC30min后,進(jìn)行了細(xì)菌的黏附和侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)100nm,200nm和500nm的PAFR拮抗劑預(yù)處理HUVEC,顯著減少了PC陽(yáng)性Aa對(duì)HUVEC的黏附和侵襲(P0.001),黏附率分別為對(duì)照組的36.29±3.52%,19.04±3.35%和7.69±3.19%；侵襲率分別為對(duì)照組的12.12±1.58%,7.08±0.29%和2.60±2.26%。 同樣,用抗PAFR抗體預(yù)處理HUVEC后Aa對(duì)HUVEC的黏附率和侵襲率分別為50.05±5.28%和39.09±6.50%,顯著降低了Aa對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和侵入(P0.001)。 3、PAFR在細(xì)菌誘導(dǎo)細(xì)胞損傷中的作用研究 我們用PAFR拮抗劑和抗PAFR抗體分別作用于細(xì)胞后,采用MTT法分析了PC陽(yáng)性和陰性Aa誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用200nm和500nm的PAFR拮抗劑和25μg/ml抗-PAFR抗體預(yù)處理HUVEC后,PC陽(yáng)性的Aa與細(xì)胞作用以后,細(xì)胞的存活率顯著升高(P0.001),從25.39±9.33%分別升高到91.12±3.14%,94.12±2.15%和65.5±1.87%。 我們同時(shí)對(duì)PC陰性的Aa進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)預(yù)處理組與未預(yù)處理的組相比,PC陰性的Aa感染]HUVEC后,細(xì)胞活力并沒有顯著增加(P0.05)。 三、磷酸肌醇信號(hào)通路在PC陽(yáng)性Aa菌株致病過程中的作用研究 1、磷脂酶C被抑制后對(duì)細(xì)菌黏附侵襲過程的影響 為了探討G蛋白偶聯(lián)受體通路是否參與了Aa黏附和侵襲到HUVEC的過程,我們采用磷脂酶C (Phospholipase C,PLC)與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合過程的抑制劑U73122和其無(wú)活性的類似物U73343預(yù)處理HUVEC,觀察細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的黏附和侵襲。結(jié)果發(fā)現(xiàn)U73122預(yù)處理組侵入到HUVEC的PC陽(yáng)性的Aa降低為對(duì)照組的12.62±2.1%(P0.001)；然而,細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的黏附率卻沒有顯著差異。與此同時(shí),用U73343預(yù)處理細(xì)胞后,PC陽(yáng)性的Aa對(duì)HUVEC的侵襲率和黏附率均沒有表現(xiàn)出顯著差異(P0.05),表明U73343不能阻斷PC與PAFR的結(jié)合及由此啟動(dòng)的信號(hào)傳遞。 2、磷脂酶C被抑制后細(xì)菌對(duì)細(xì)胞損傷的影響 分別用U73122和U73343預(yù)處理HUVEC30min后,與PC陽(yáng)性的Aa進(jìn)行作用2h,MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活的情況。U73122預(yù)處理HUVEC后,對(duì)PC誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷表現(xiàn)出了顯著的保護(hù)作用,]3UVEC的細(xì)胞存活率從39.31±6.43%升高到了93.09±5.46%。 與此相反,U73343預(yù)處理與非預(yù)處理組之間,PC陽(yáng)性的Aa感染HUVEC后所觀察到的細(xì)胞存活率相似(P=0.664)。我們同時(shí)分析了PC陰性的Aa感染用U73122和U73343預(yù)處理HUVEC后的細(xì)胞存活率,發(fā)現(xiàn)U73122和U73343預(yù)處理組與未處理組之間細(xì)胞的存活率沒有顯著差異(P=0.520)。 3、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的測(cè)定 為了進(jìn)一步證實(shí)U73122阻斷了PLC與G蛋白偶聯(lián)受體PAGFR的結(jié)合從而抑制了PC陽(yáng)性的Aa侵入到HUVEC,用U73122預(yù)處理細(xì)胞后,我們采用fura2/AM檢測(cè)了PC陽(yáng)性的Aa侵入到HUVEC的過程中的細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用U73122預(yù)處理細(xì)胞后幾乎完全抑制了細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加(P=0.16)。 四、Clathrin及β-arrestin-1/-2在PC陽(yáng)性Aa致病過程中的作用研究 1、clathrin被抑制后對(duì)細(xì)菌黏附侵襲的影響 為了探討網(wǎng)格蛋白(clathrin)和β-arrestins是否參與了Aa內(nèi)吞入HUVEC的過程,我們研究了的網(wǎng)格蛋白的抑制劑在Aa黏附和侵襲HUVEC的過程中的影響。氯丙嗪(chlorpromazine, CPZ)、單丹磷酰戊二胺(monodansylcadaverine, MDC)是網(wǎng)格蛋白在裝配及循環(huán)再利用過程中的兩個(gè)特異性抑制劑,用MDC和CPZ預(yù)處理細(xì)胞以后,PC陽(yáng)性的Aa侵襲率分別降低為對(duì)照組的41.33±2.59%和43.22±2.67%(P0.001)。然而,MDC或CPZ預(yù)處理組和未處理組之間,Aa對(duì)HUVEC的黏附率沒有顯著差異(P0.05),表明MDC或CPZ對(duì)網(wǎng)格蛋白的抑制作用可能不能阻止Aa對(duì)細(xì)胞的黏附過程。 2、β-arrestin-1和β-arrestin-2對(duì)Aa黏附侵襲的影響 此外,為了證實(shí)β-arrestins參與了Aa內(nèi)吞入HUVEC的過程,我們用siRNA的方法干擾了HUVEC細(xì)胞內(nèi)的β-arrestins,然后將Aa作用于轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,觀察其對(duì)細(xì)胞的黏附和侵襲的情況。 首先,我們檢測(cè)了β-arrestin-1或-2的siRNA轉(zhuǎn)染HUVEC后的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率及細(xì)胞內(nèi)β-arrestins的表達(dá)水平。熒光顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況,轉(zhuǎn)染率均在60%以上。P-arrestin-1或-2的siRNA轉(zhuǎn)染后,與未轉(zhuǎn)染組及陰性對(duì)照組相比,有針對(duì)性的降低了β-arrestins的表達(dá)。 然后,用PC陽(yáng)性的Aa作用于β-arrestins siRNA轉(zhuǎn)染后的HUVEC,發(fā)現(xiàn)可有效地阻斷Aa侵入到細(xì)胞內(nèi),侵襲率分別為對(duì)照組的53.12±2.81%和56.00±2.37%(P0.001)。但是,黏附到細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)沒有顯著差異(P=0.336),這表明β-arrestins siRNA不能抑制Aa的PC與細(xì)胞表面PAFR的結(jié)合。同時(shí),陰性對(duì)照組siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,Aa對(duì)HUVEC的黏附和侵襲均沒有顯著差異。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,兩組間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；與常數(shù)組之間的比較采用單樣本t檢驗(yàn),用Bonferroni法校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)；多組間比較采用單因素方差分析,不同處理組之間的兩兩比較,方差齊時(shí)采用LSD法,方差不齊時(shí)采用Dunnett'sT3法。相關(guān)性分析采用Spearman法。P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0軟件。 結(jié)論 1、我們成功分離得到了Aal臨床分離株并成功篩選出了磷脂酰膽堿陽(yáng)性表達(dá)的Aa菌株,為下一步的實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。 2、PC有助于PC陽(yáng)性的Aa對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和侵襲；同時(shí),PAFR在PC陽(yáng)性的Aa對(duì)宿主細(xì)胞的黏附、侵襲及誘導(dǎo)胞損傷的過程中發(fā)揮了重要作用。 3、PAFR介導(dǎo)的磷酸肌醇信號(hào)通路參與了PC陽(yáng)性的Aa在黏附、侵襲細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的過程。 4、網(wǎng)格蛋白clathrin和P-arrestins參與了PAFR介導(dǎo)的表達(dá)PC的Aa對(duì)HUVEC的侵襲過程。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R781.42

【參考文獻(xiàn)】

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1 鐘德鈺;章錦才;張雄;Sirkka Asikainen;;伴放線放線桿菌血液感染菌株的血清型分析[J];廣東牙病防治;2010年09期

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本文編號(hào)：2408696