【摘要】：目的：本研究擬在前期口腔流行病學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)上,以甘肅保安族兒童為研究對(duì)象,通過構(gòu)建細(xì)菌16SrRNA克隆文庫,進(jìn)行序列比對(duì)。從不同的分類學(xué)水平,對(duì)齲病組和無齲組兒童的唾液微生物群落結(jié)構(gòu),進(jìn)行差異性對(duì)比分析。探尋該地區(qū)兒童口腔中的主要致齲微生物,為進(jìn)一步研究微生物的致齲機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持,并從病因?qū)W角度入手,積極采取相應(yīng)措施進(jìn)行早期預(yù)防,降低齲病發(fā)病率,促進(jìn)兒童口腔健康。方法：按照WHO取樣標(biāo)準(zhǔn),選取20例保安族兒童為研究對(duì)象,分為齲病(BC)組和無齲(BH)組。采集非刺激性唾液,提取細(xì)菌基因組DNA,通過PCR擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA獲得目的片段,并轉(zhuǎn)化至E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽性克隆,構(gòu)建16SrRNA克隆文庫,進(jìn)行16SrRNA測序；剔除測序后的載體和嵌合體序列,MOTHUR軟件進(jìn)行OTU分類計(jì)算,并進(jìn)行微生物菌群多樣性分析；利用RDP數(shù)據(jù)庫按不同的分類水平對(duì)序列進(jìn)行分類,然后將序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行同源性比對(duì)；利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；最后進(jìn)行主成分分析、聚類分析,并結(jié)合SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：(1)1000條序列經(jīng)篩選后獲得960條合格序列(平均讀長為850bp),BC組為573條,BH組為387條。經(jīng)MOTHUR軟件計(jì)算,共得到170個(gè)OTU,歸屬于5個(gè)門,12個(gè)綱,16目,23個(gè)科,28個(gè)屬。(2)多樣性指數(shù)分析結(jié)果顯示,兩文庫的庫容良好,BC組Shannon指數(shù)高于BH組,說明BC組多樣性更為豐富,但是兩文庫之間的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù),無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。(3)5個(gè)細(xì)菌門：厚壁菌門(Firmicute)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和梭桿菌門(Fusobacteria),除了梭桿菌門在BC組的檢出率低于1%外,其余4個(gè)菌門檢出率均大于1%；對(duì)檢出率進(jìn)行卡方檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)只有厚壁菌門和變形菌門在兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；菌門豐度進(jìn)行秩和檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)5個(gè)菌門在兩組之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。(4)28個(gè)菌屬中只有鏈球菌屬(Streptococcus)存在于所有樣本中,兩組之間的優(yōu)勢菌屬也存在差異。BC組共有11個(gè)優(yōu)勢菌屬：鏈球菌(Streptococcus)、孿生菌屬(Gemella)、顆粒鏈菌屬(Granulicatella)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、韋榮氏球菌屬(Veillonlla)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、奈瑟菌屬(Neisseria)、羅氏菌屬(Rothia)、伴放線菌屬(Aggregatibacter)、營養(yǎng)缺陷菌屬(Abiotrophia)以及假單胞菌屬(Pseudomonas)。BH組共有8個(gè)：鏈球菌屬(Streptococcus)、孿生菌屬(Gemella)、顆粒鏈菌屬(Granulicatella)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、韋榮氏球菌屬(Veillonella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、奈瑟菌屬(Neisseria)、以及假單胞菌屬(Pseudomonas)。(5)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析,發(fā)現(xiàn)只有羅氏菌屬(Rothia)的物種豐度和檢出率在兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);PCA及聚類分析結(jié)果顯示,兩組之間的微生物群落存在一定的差異性,且BC組的差異較BH組大。(6)除目前已知的微生物菌屬之外,還存在一些尚不能準(zhǔn)確分類到屬的物種,這些物種在齲病發(fā)生或者維持口腔健康狀態(tài)中的作用需要進(jìn)一步探索。結(jié)論：保安族兒童口腔唾液微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定差異性。乳桿菌屬、羅氏菌屬、伴放線菌屬、營養(yǎng)缺陷菌屬等優(yōu)勢菌屬為該人群的主要致齲菌,尤其是羅氏菌屬的作用更為顯著。鏈球菌屬在所有的樣本中均被檢測到,并且豐度最高,是口腔菌群中比例最大的菌屬。在口腔微生態(tài)系這個(gè)復(fù)雜的環(huán)境中,尚有很多細(xì)菌在齲病發(fā)生中所發(fā)揮的作用需要深入研究,如羅氏菌屬、伴放線菌屬、營養(yǎng)缺陷菌屬等；16SrRNA克隆文庫法是一種較成熟且全面的研究方法,有利于口腔微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究。
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【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R781.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 蘇勇;朱偉云;;分子生物學(xué)技術(shù)在胃腸道微生態(tài)中應(yīng)用研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報(bào);2006年04期

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本文編號(hào)：2335438