【摘要】：目的:1.體外分離培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblasts,HGFs),檢測骨向誘導(dǎo)的HGFs在健康根片和牙周病根片上的附著、細(xì)胞活性以及成骨分化能力,觀察骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)聯(lián)合地塞米松(dexamethasone,DEX)對其的作用情況。2.將成骨誘導(dǎo)后的HGFs與Bio-Oss骨粉復(fù)合,觀察其對裸鼠顱骨缺損的成骨修復(fù)效果,以及BMP-2聯(lián)合DEX的作用。3.制作成骨誘導(dǎo)后HGFs細(xì)胞膜片,將其植入到裸鼠顱骨缺損處,觀察其對顱骨缺損的成骨修復(fù)效果,以及BMP-2聯(lián)合DEX的作用,為HGFs以及細(xì)胞因子在牙周組織再生的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。方法:1.制備約4 mm×4 mm×1 mm大小的健康和病變牙根片,采用組織塊法培養(yǎng)牙齦成纖維細(xì)胞,培養(yǎng)到第三代后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為三組,分別是成骨誘導(dǎo)A組,成骨誘導(dǎo)B組,無誘導(dǎo)N組(對照組)。A組:骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(達(dá)爾伯克氏必需基本培養(yǎng)基(dulbecco's minimum essential medium,DMEM)、3%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、5 mg/L抗壞血酸、10-3 mol/Lβ-甘油磷酸鈉以及2×10-3 mol/L L-谷氨酰胺),10-8 mol/L DEX和50 ng/mL BMP-2;B組:骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基;N組:DMEM和3%FBS。將HGFs接種到健康、病變根片上,于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)根片上附著的細(xì)胞數(shù),四甲基偶氮唑鹽(3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-5-3-carboxymethoxyphenyl-2-4-sulfophenyl-2H-tetrazo lium,inner salt,MTS)比色法檢測根面上細(xì)胞活性,掃描電鏡檢測細(xì)胞在根片上附著情況,對硝基苯基磷酸二鈉(p-nitrophenol phosphate,PNPP)法定量和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色檢測各組細(xì)胞堿性磷酸酶活性,茜素紅染色檢測各組細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成。2.構(gòu)建裸鼠顱骨缺損模型,將三組細(xì)胞與Bio-Oss骨粉復(fù)合,分別植入到裸鼠顱骨缺損模型中,6周后取材進(jìn)行HE染色,檢測各組復(fù)合物的顱骨缺損修復(fù)情況。3.構(gòu)建三組HGFs細(xì)胞膜片,植入到裸鼠顱骨缺損處,6周后取材進(jìn)行HE染色,檢測各組膜片的顱骨缺損修復(fù)情況。結(jié)果:1.培養(yǎng)至1、3、5、7天,BMP-2聯(lián)合DEX誘導(dǎo)的HGFs在根片上細(xì)胞數(shù)量明顯多于普通誘導(dǎo)組和對照組(P0.05),健康根片上附著的細(xì)胞數(shù)量明顯多于病變根片上的細(xì)胞(P0.05)。2.培養(yǎng)至3、5、7天,BMP-2聯(lián)合DEX誘導(dǎo)的HGFs在根片上細(xì)胞活性明顯高于普通誘導(dǎo)組和對照組(P0.05),健康根片上附著的細(xì)胞活性明顯高于病變根片上的細(xì)胞(P0.05)。3.掃描電鏡結(jié)果顯示:培養(yǎng)至3、7天,BMP-2聯(lián)合DEX誘導(dǎo)的HGFs附著在根片上細(xì)胞數(shù)量明顯多于普通誘導(dǎo)組和對照組,健康根片上附著的細(xì)胞數(shù)量明顯多于病變根片上的細(xì)胞。4.PNPP結(jié)果:培養(yǎng)至1、3、5、7天:BMP-2聯(lián)合DEX誘導(dǎo)的HGFs在根片上ALP活性明顯高于普通誘導(dǎo)組和對照組(P0.05),健康根片上附著的細(xì)胞ALP活性明顯強(qiáng)于病變根片組(P0.05)。培養(yǎng)7天時(shí)ALP染色顯示BMP-2聯(lián)合DEX誘導(dǎo)組藍(lán)紫色沉淀最明顯,培養(yǎng)21天時(shí)茜素紅染色顯示BMP-2聯(lián)合DEX誘導(dǎo)組紅色沉淀最明顯。5.細(xì)胞+Bio-oss體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中HE染色結(jié)果顯示:A組及B組顱骨缺損處可見大量的條索狀、網(wǎng)狀基質(zhì)形成。而C組缺損處僅見少量基質(zhì)形成。計(jì)量學(xué)結(jié)果:成骨誘導(dǎo)組基質(zhì)面積比明顯大于無成骨誘導(dǎo)組,且A組基質(zhì)面積比大于B組(P0.05)。6.三組細(xì)胞膜片經(jīng)21天左右成型。HE染色結(jié)果顯示成骨誘導(dǎo)細(xì)胞膜片組缺損邊緣可見大量條索狀、網(wǎng)狀基質(zhì)形成。而非誘導(dǎo)細(xì)胞膜片組缺損處僅見少量基質(zhì)形成。計(jì)量學(xué)結(jié)果:成骨誘導(dǎo)組基質(zhì)面積比明顯大于無成骨誘導(dǎo)組,且A組基質(zhì)面積比大于B組(P0.05)。結(jié)論:1.牙周病變根片影響HGFs的附著、細(xì)胞活性以及成骨分化。2.骨誘導(dǎo)的HGFs能在根面上粘附以及成骨分化。3.無論在健康根片還是病變根片上,BMP-2聯(lián)合DEX可明顯促進(jìn)HGFs在根面上的附著、細(xì)胞活性以及成骨分化。4.HGFs骨誘導(dǎo)后,特別是BMP-2聯(lián)合DEX誘導(dǎo),會促進(jìn)顱骨缺損區(qū)基質(zhì)形成,為進(jìn)一步成骨提供必要條件。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R781.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2303967