本文選題：SHEDs + VEGF-A�。� 參考：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:體外獲取和分離人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞并采用胰酶消化、有限稀釋法對其純化,培養(yǎng)并分析干細(xì)胞干性;采用VEGF-A與SB-431542聯(lián)合誘導(dǎo)人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞,初步探討其分化為內(nèi)皮細(xì)胞的高效性,為研究牙源性干細(xì)胞高效分化內(nèi)皮細(xì)胞提供一種新思路。方法:1、人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞的獲取、分離、純化、培養(yǎng)及細(xì)胞干性鑒定選取山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院兒牙科因滯留而拔除的健康乳前牙,在無菌狀態(tài)下獲取滯留乳牙牙髓組織,并采用胰酶消化法獲取單細(xì)胞的懸液,有限稀釋法進(jìn)行分離、純化。倒置顯微鏡下觀察人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞原代、傳代細(xì)胞形態(tài)和生長狀況。流式細(xì)胞儀檢測分析CD45、CD73、CD90、CD105表面抗原陽性表達(dá)情況。選取第三代處于生長對數(shù)期的人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞,體外成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo),向脂肪組織分化。觀察細(xì)胞形態(tài)變化及胞內(nèi)成脂情況,4周后油紅-0染色。選取第三代人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞,體外成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng),第1周和第3周分別行堿性磷酸酶和茜素紅染色,檢測是否有礦化結(jié)節(jié)的形成,進(jìn)一步鑒定人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞多向分化能力。2、體外VEGF-A與SB-431542聯(lián)合誘導(dǎo)人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化:將處在生長對數(shù)期的第三代人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞以3×103個/cm2分別接種于α-MEM、VEGF-A、VEGF-A+SB-431542聯(lián)合培養(yǎng)基中,隔天更換一次培養(yǎng)液,分別提取第7天、第14天的上述細(xì)胞,RT-PCR、Western blot分別檢測三組實(shí)驗內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因、蛋白表達(dá)情況。統(tǒng)計分析:所有實(shí)驗組一式三份進(jìn)行,所有數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)來表示。使用單因素方差分析確定是否具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異,并將具有統(tǒng)計學(xué)意義的閾值設(shè)定為P0.05。結(jié)果:1、酶消化法和有限稀釋法獲得了純的人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞,顯微鏡下人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞排列緊密,呈集落狀生長。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原CD45陽性檢出率為2.8%,CD73陽性檢出率為99.8%,CD90陽性檢出率為99.5%,CD105陽性檢出率為94.2%。人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)4周后,油紅-0染色陽性細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)橙紅色顆粒。成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo),有鈣化結(jié)節(jié)逐漸形成,茜素紅染色呈現(xiàn)橘紅色或深紅色;ALP染色細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)均勻的藍(lán)色。2、實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)結(jié)果顯示:誘導(dǎo)7天、14天無論是單純的VEGF-A組還是VEGF-A+SB-431542組,均有特異性內(nèi)皮細(xì)胞分子(VEGFR-2、VEGFR-1、EphrinB2 和 Tie-2)的表達(dá)。誘導(dǎo) 7 天后,與單純 VEGF-A組相比,用VEGF-A和SB-431542聯(lián)合培養(yǎng)的人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞顯示出更高的VEGFR-2表達(dá)(P0.05),VEGFR-1、CD31也呈現(xiàn)出相似的高表達(dá)狀態(tài)。與單獨(dú)的VEGF-A組相比,人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞在含有VEGF-A和SB-431542培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)14天后內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因(VEGFR-2、VEGFR-1、EphrinB2和Tie-2)表達(dá)顯著增加(P0.05)。Western blot檢測相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況:培養(yǎng)7天和14天,VEGF-A組及VEGF-A+SB-431542組均能產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞的特異性蛋白(CD31和VEGFR-2)。但無論是第7天還是第14天,聯(lián)合組誘導(dǎo)分化的內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)量均高于VEGF-A單純組。結(jié)論:1、體外獲取、分離并采用酶消化法和有限稀釋法可以獲得純的人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞表達(dá)早期的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物,人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞可以向成骨和成脂誘導(dǎo)分化,具有多向分化潛能,因而具有干細(xì)胞干性。2、VEGF-A單純誘導(dǎo)人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞可以向內(nèi)皮細(xì)胞分化,但VEGF-A與SB-4315412聯(lián)合誘導(dǎo)則可以顯著增強(qiáng)這一過程。
[Abstract]:Objective: to obtain and isolate human deciduous dental pulp stem cells from human deciduous teeth in vitro and to use trypsin digestion. The purification, culture and analysis of stem cells were carried out by the finite dilution method. VEGF-A and SB-431542 were used to induce human deciduous dental pulp stem cells, and the efficiency of differentiation into endothelial cells was preliminarily studied to study the high efficiency of odontogenic stem cells differentiation. The skin cells provide a new idea. Methods: 1, the extraction, isolation, purification, culture and dry identification of the dental pulp stem cells from the deciduous teeth were selected to select the healthy anterior teeth extracted by the dental dental hospital of Shandong University and obtain the retained deciduous teeth in the aseptic state, and the single cell suspension was obtained by trypsin digestion. The finite dilution method was used to separate and purify. The original cells of the pulp stem cells of the deciduous teeth and the cell morphology and growth status were observed under the inverted microscope. The positive expression of the surface antigen of CD45, CD73, CD90 and CD105 was detected by flow cytometry. The third generations of human deciduous dental pulp stem cells in deciduous teeth and in vitro lipid inducer were selected. Induction, differentiation to adipose tissue. Observe cell morphological changes and intracellular fat formation. After 4 weeks, oil red -0 staining. Third generations of deciduous dental pulp stem cells were selected and cultured in vitro. Alkaline phosphatase and alizarin red staining were performed for first and third weeks, respectively, to detect the formation of mineralized nodules, and to further identify human abscission. The multiple differentiation ability of the pulp stem cells was.2, and in vitro VEGF-A and SB-431542 combined to induce the human deciduous tooth pulp stem cells to differentiate into endothelial cells. The third generation of deciduous dental pulp stem cells in the logarithmic period of growth will be inoculated with 3 x 103 /cm2 respectively in the joint culture medium of alpha -MEM, VEGF-A, VEGF-A +SB-431542, and replaced every other day. The cells were extracted for seventh days and fourteenth days respectively, RT-PCR, and Western blot were used to detect the endothelial cells related genes and protein expression in the three groups respectively. Statistical analysis: all experimental groups were carried out in three copies, and all the values were expressed with mean mean standard deviation (SD). The statistical significance was determined by single factor variance analysis. The threshold of statistical significance was set as P0.05. results: 1, the pure human deciduous dental pulp stem cells were obtained by enzyme digestion and finite dilution method. Under the microscope, the stem cells of the deciduous teeth and dental pulp stem cells were close and colony-shaped. The positive detection rate of the cell surface antigen CD45 was detected by flow cytometry, and the positive detection of CD73 was positive. The rate of expetion was 99.8%, the positive rate of CD90 was 99.5%, and the positive rate of CD105 positive was 4 weeks after the induction of 94.2%. human deciduous tooth pulp stem cells. The positive cells in the oil red -0 staining were orange red granules. The calcified nodules were formed gradually, alizarin red staining showed orange red or deep red, and ALP stained cell cytoplasm. A homogeneous blue.2 and real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR) showed that the expression of specific endothelial cell molecules (VEGFR-2, VEGFR-1, EphrinB2 and Tie-2) was induced for 7 days, 14 days in both simple VEGF-A and VEGF-A+SB-431542 groups. After 7 days of inducement, compared with the simple VEGF-A group, VEGF-A and SB-431542 were used. The cultured human deciduous dental pulp stem cells showed a higher VEGFR-2 expression (P0.05), VEGFR-1, and CD31 also showed a similar state of high expression. Compared with the single VEGF-A group, the human deciduous dental pulp stem cells were cultured for 14 days in the VEGF-A and SB-431542 culture medium for endothelial cell related genes (VEGFR-2, VEGFR-1, EphrinB2, and EphrinB2). Tie-2) expression significantly increased (P0.05).Western blot detection of the expression of corresponding protein: 7 days and 14 days of culture, VEGF-A and VEGF-A+SB-431542 groups could produce specific proteins (CD31 and VEGFR-2) of endothelial cells. However, the specific protein expression of endothelial cells induced by the combined group was higher than VEGF-A, no matter seventh days or fourteenth days. Conclusion: 1, the pure human deciduous dental pulp stem cells can be obtained by enzyme digestion and finite dilution method in vitro. Flow cytometry is used to detect the early mesenchymal stem cell markers in human deciduous dental pulp stem cells, and the human deciduous tooth pulp stem cells can differentiate into osteogenesis and lipid. As a result, the stem cells have dry.2, and VEGF-A can differentiate into endothelial cells by simple induction of human deciduous tooth pulp stem cells, but the combination of VEGF-A and SB-4315412 can significantly enhance this process.
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R781

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本文編號：1899189