發(fā)布時(shí)間：2018-03-12 19:25

  本文選題：面神經(jīng)　切入點(diǎn)：脫細(xì)胞神經(jīng)　出處：《中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分、殼聚糖導(dǎo)管預(yù)防周圍神經(jīng)瘢痕的實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)一殼聚糖導(dǎo)管預(yù)防兔面神經(jīng)周瘢痕的實(shí)驗(yàn)研究目的：周圍神經(jīng)解剖性損傷后，神經(jīng)周瘢痕的形成會壓迫神經(jīng)，阻礙軸突的再生，影響神經(jīng)功能的恢復(fù)。應(yīng)用可生物降解的殼聚糖導(dǎo)管作為物理屏障，觀察其對兔面神經(jīng)周瘢痕及神經(jīng)內(nèi)血運(yùn)的影響。方法：新西蘭大白兔36只，行腮腺大部切除，面神經(jīng)解剖性損傷造模。隨機(jī)分為覆蓋組、包裹組、自體對照組。于術(shù)后4、12周采用Petersen分級評估面神經(jīng)與周圍組織粘連情況，采用組織學(xué)染色方法檢測面神經(jīng)周瘢痕及神經(jīng)內(nèi)血管密度，并采用觸須運(yùn)動(dòng)、透射電鏡、神經(jīng)電生理等方法對面神經(jīng)功能進(jìn)行評估。 結(jié)果：術(shù)后4周時(shí)petersen評分無明顯差異（P0.05），12周時(shí)瘢痕粘連較明顯，覆蓋組與包裹組解剖時(shí)較自體對照組容易（P0.01）；術(shù)后4周覆蓋組有髓神經(jīng)纖維直徑、髓鞘厚度、神經(jīng)纖維數(shù)量均優(yōu)于包裹組及對照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）；術(shù)后4、12周對照組膠原厚度大于覆蓋組與包裹組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）；術(shù)后12周覆蓋組與自體對照組兩者纖維直徑較接近，排列均整齊，髓鞘壁較厚，兩組間無明顯差異（P0.05），包裹組纖維直徑、髓鞘壁厚度、神經(jīng)內(nèi)血管密度均較小，與前兩者存在顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）。結(jié)論：殼聚糖導(dǎo)管作為物理屏障覆蓋于面神經(jīng)表面可有效減少神經(jīng)周瘢痕的形成、減輕瘢痕對面神經(jīng)功能的影響。 實(shí)驗(yàn)二、殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合透明質(zhì)酸預(yù)防大鼠坐骨神經(jīng)瘢痕的實(shí)驗(yàn)研究 目的：觀察將殼聚糖導(dǎo)管與透明質(zhì)酸聯(lián)合應(yīng)用對大鼠坐骨神經(jīng)1cm鉗夾性損傷后神經(jīng)功能的影響。 方法：選用清潔級健康成年SD大鼠60只，坐骨神經(jīng)鉗夾損傷造模，隨機(jī)分為覆蓋組、覆蓋+透明質(zhì)酸組、鉗夾組、鉗夾+透明質(zhì)酸組，每組15只。于術(shù)后4、8、12周對坐骨神經(jīng)與周圍組織粘連、神經(jīng)周瘢痕增生情況進(jìn)行觀察，并對神經(jīng)功能進(jìn)行坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、組織學(xué)和神經(jīng)電生理檢測。 結(jié)果：術(shù)后4周時(shí)坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、petersen評分、神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)、髓鞘厚度、有髓神經(jīng)纖維平均直徑各組間均無明顯差異；術(shù)后8周、12周時(shí)，鉗夾+透明質(zhì)酸組其坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、petersen評分、神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)、髓鞘厚度、有髓神經(jīng)纖維平均直徑等各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于對照組。術(shù)后4、8、12周時(shí)神經(jīng)外膜膠原厚度檢測各組均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.01），12周時(shí)HA組神經(jīng)外膜膠原厚度要厚于殼聚糖組及殼聚糖+HA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）。 結(jié)論：殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合透明質(zhì)酸可以促進(jìn)鼠坐骨神經(jīng)鉗夾損傷的恢復(fù)，減少其神經(jīng)周瘢痕的產(chǎn)生。 實(shí)驗(yàn)三、殼聚糖導(dǎo)管植入對腮腺術(shù)后面神經(jīng)功能恢復(fù)的臨床效果觀察 目的：觀察并比較殼聚糖導(dǎo)管應(yīng)用于腮腺手術(shù)后對術(shù)后患者面神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。 方法：75例腮腺腫瘤患者接受腮腺淺葉摘除術(shù)或腮腺全切手術(shù)，分為兩組，一組應(yīng)用殼聚糖導(dǎo)管覆蓋面神經(jīng)總干及各分支，一組為常規(guī)手術(shù)作為對照。在手術(shù)后7天、1月、3月、6月和9月分別進(jìn)行超聲檢查和血常規(guī)檢查并按HB標(biāo)準(zhǔn)觀察面神經(jīng)功能。 結(jié)果：隨訪時(shí)間9月-50月，平均21.7月，75名患者中50名行腮腺淺葉摘除，25名行腮腺全切術(shù)，手術(shù)后不同時(shí)間的血常規(guī)檢及超聲查顯示無論是應(yīng)用殼聚糖組還對照組，患者均無異常，表明殼聚糖導(dǎo)管植入體內(nèi)后不會引起不良反應(yīng)。術(shù)后7天即刻面癱發(fā)生率殼聚糖組（29/32，90.6%），對照組（39/43,90.7%）；永久性面癱發(fā)生率面癱發(fā)生率殼聚糖組（0/32，0%），對照組（2/43,4.7%）均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。術(shù)后7天對兩組患者面神經(jīng)功能行HB評分，結(jié)果兩組患者面神經(jīng)麻痹嚴(yán)重程度無顯著性差異（P0.05）。對患者面神經(jīng)恢復(fù)速度進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)殼聚糖組神經(jīng)恢復(fù)速度快于對照組，差異有顯著性意義（P0.01）。結(jié)論：殼聚糖導(dǎo)管具有良好的生物相容性，植入體內(nèi)無不良反應(yīng)，在腮腺手術(shù)后應(yīng)用殼聚糖導(dǎo)管覆蓋面神經(jīng)對其功能恢復(fù)有一定促進(jìn)作用。 第二部分GDNF基因慢病毒載體的構(gòu)建、病毒的包裝及MSCs細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 目的：構(gòu)建攜帶EGFP和GDNF的慢病毒載體，利用其轉(zhuǎn)染MSCs并對其進(jìn)行鑒定，，獲得可穩(wěn)定過表達(dá)GDNF的MSCs。 方法：通過PCR擴(kuò)增，BamHI和AscI雙酶酶切目的基因片段， T4DNA連接酶連接,將目的基因GDNF插入慢病毒載體pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP,構(gòu)建重組慢病毒。在lipofectamine2000介導(dǎo)下將構(gòu)建成功的慢病毒轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞系(293T)，包裝生產(chǎn)慢病毒,并測定病毒滴度。將包裝好的慢病毒感染BMSCs,并對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞行病毒轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（MOI值）測定，篩選最佳感染復(fù)數(shù)。Western、RT-PCR分別檢測轉(zhuǎn)然后GDNF蛋白和mRNA的表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀觀察轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果：成功構(gòu)建攜帶EGFP和GDNF的慢病毒，慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs后96小時(shí)強(qiáng)熒光表達(dá)，當(dāng)MOI值為25時(shí)細(xì)胞熒光表達(dá)強(qiáng)且活性較好。Western和RT-PCR檢測證實(shí)GDNF在MSCs中成功表達(dá)，流式細(xì)胞儀觀察轉(zhuǎn)染效率為94.2%。結(jié)論：成功將攜帶EGFP和GDNF的慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs，獲得過表達(dá)GDNF基因的MSCs，為后期實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。 第三部分、脫細(xì)胞神經(jīng)復(fù)合GDNF轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔面神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)一、周圍神經(jīng)脫細(xì)胞方法的篩選 目的：采用不同的方法對兔面神經(jīng)進(jìn)行脫細(xì)胞處理，對脫細(xì)胞神經(jīng)組織學(xué)及體內(nèi)植入進(jìn)行檢測，為面神經(jīng)脫細(xì)胞方法的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：分別采用凍融法、化學(xué)法及凍融+酶消化法處理兔面神經(jīng)，對處理的神經(jīng)進(jìn)行HE染色、掃描電鏡觀察和透射電鏡觀察其組織學(xué)結(jié)構(gòu)；并將不同方法處理的神經(jīng)進(jìn)行兔背部皮下植入，于2、4周處死動(dòng)物，行大體觀察及組織學(xué)觀察。 結(jié)果：組織學(xué)觀察見化學(xué)法（Hudson法）、凍融+酶消化法處理的神經(jīng)其髓鞘清除較徹底，只有部分區(qū)域可見極少量髓鞘殘留，凍融法處理的神經(jīng)內(nèi)可見髓鞘皺縮、變形但有較多殘留。皮下埋植實(shí)驗(yàn)觀察見單純凍融法處理的神經(jīng)內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤稍多，主要分布在神經(jīng)束周邊的基底膜間隙中，Hudson法、凍融+酶消化法處理的神經(jīng)未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤。 結(jié)論：凍融+酶消化法處理方法簡單、神經(jīng)支架結(jié)構(gòu)保存完整，神經(jīng)內(nèi)髓鞘等抗原成分去除較徹底，是一種良好的去細(xì)胞方法，為后期實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)二、脫細(xì)胞神經(jīng)復(fù)合GDNF轉(zhuǎn)染的MSCs修復(fù)兔面神經(jīng)缺損 目的：以脫細(xì)胞面神經(jīng)為支架，復(fù)合GDNF轉(zhuǎn)染的MSCs修復(fù)兔面神經(jīng)多分支缺損，觀察其對面神經(jīng)再生及對面神經(jīng)元存活的作用。 方法：新西蘭大白兔60只，面神經(jīng)解剖性損傷造模。完全隨機(jī)分為：脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植組（ANA），脫細(xì)胞異體神經(jīng)+間充質(zhì)干細(xì)胞組（AN-MSCs），脫細(xì)胞異體神經(jīng)+GDNF轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞（AN-G-MSCs），自體神經(jīng)移植組（Control）。于術(shù)后4、12、24周時(shí)取材，對動(dòng)物行大體觀察并采用觸須運(yùn)動(dòng)、神經(jīng)電生理等方法對面神經(jīng)功能進(jìn)行評估，分別對移植神經(jīng)的近端及遠(yuǎn)端行甲苯暗藍(lán)染色、透射電鏡觀察其再生軸突的變化。 結(jié)果：對面神經(jīng)總干處神經(jīng)軸突形態(tài)計(jì)量學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)后4周時(shí)脫細(xì)胞神經(jīng)移植組其神經(jīng)軸突計(jì)數(shù)、髓鞘厚度、髓鞘直徑均明顯低于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；術(shù)后12、24周時(shí)檢測發(fā)現(xiàn)各組間無明顯差異（P0.05）。面神經(jīng)移植物遠(yuǎn)端術(shù)后12周時(shí)面神經(jīng)各分支檢測脫細(xì)胞神經(jīng)移植與MSCs組神經(jīng)軸突計(jì)數(shù)、髓鞘厚度、髓鞘直徑均明顯低于GDNF組與自體神經(jīng)移植組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。術(shù)后24周時(shí)脫細(xì)胞神經(jīng)移植各項(xiàng)指標(biāo)均低于其他三組. 結(jié)論：將脫細(xì)胞神經(jīng)與GDNF轉(zhuǎn)染的MSCs聯(lián)合應(yīng)用可成功修復(fù)兔面神經(jīng)多分支缺損，其修復(fù)效果優(yōu)于單純應(yīng)用脫細(xì)胞神經(jīng)，且可以一定程度上保護(hù)面神經(jīng)元的存活。 實(shí)驗(yàn)三同種異體神經(jīng)移植修復(fù)面神經(jīng)缺損的長期隨訪觀察 目的：臨床應(yīng)用脫細(xì)胞神經(jīng)移植修復(fù)面神經(jīng)缺損，并進(jìn)行長期的隨訪，觀察其修復(fù)效果及安全性。 方法：2004年7月至2013年7月，因外傷或腮腺惡性腫瘤侵襲術(shù)中切除導(dǎo)致的面神經(jīng)缺損44例，最終共有35例神經(jīng)缺損修復(fù)患者完成隨訪觀察，其中自體神經(jīng)移植20例，脫細(xì)胞神經(jīng)移植15例。術(shù)后最短隨訪時(shí)間為9個(gè)月，隨訪時(shí)分別進(jìn)行局部超聲檢查和血常規(guī)檢查，并按HB標(biāo)準(zhǔn)觀察面神經(jīng)功能。 結(jié)果：隨訪時(shí)間9月-9年，面神經(jīng)缺損長度10mm-50mm，其中術(shù)中一期缺損修復(fù)26例，二期手術(shù)移植9例，二期手術(shù)距損傷時(shí)間2天-3個(gè)月。術(shù)后隨訪時(shí)的血常規(guī)檢及超聲查均未發(fā)現(xiàn)無異常，表明脫細(xì)胞神經(jīng)植入體內(nèi)后未引起明顯的不良反應(yīng)。最終自體神經(jīng)移植組與脫細(xì)胞神經(jīng)移植組有意義的功能恢復(fù)分別為85%（17/20）和80%（12/15），無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）；術(shù)后HB分級比較發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞神經(jīng)移植神經(jīng)功能恢復(fù)情況稍弱于自體神經(jīng)移植，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)論：采用脫細(xì)胞神經(jīng)在臨床上修復(fù)面神經(jīng)缺損并進(jìn)行長期的隨訪觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞神經(jīng)可以修復(fù)面神經(jīng)缺損，長期隨訪未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，其修復(fù)與自體神經(jīng)移植接近。脫細(xì)胞神經(jīng)移植可成為臨床面神經(jīng)缺損修復(fù)的一種選擇。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R782.2

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本文編號：1602964