本文關鍵詞：牽張成骨中骨髓間充質干細胞遷移調控機制的研究　出處：《第四軍醫(yī)大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：牽張成骨(Distraction osteogenesis,DO)是一種重要組織工程技術。因其在治療顱面部復雜畸形、缺損中的獨特優(yōu)勢,DO廣受學者們青睞,具有光明的臨床應用前景。然而,目前DO的成骨機理尚未明了。研究表明,骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)在DO新骨生成中發(fā)揮關鍵作用。而牽張應力下局部BMMSCs向骨截斷區(qū)的遷移是DO骨再生的前提。本實驗旨在探索牽張應力下,BMMSCs的分子通路改變,及相關信號分子對BMMSCs遷移的影響,并且探究調控相關信號分子對DO骨再生的影響,從而為探明骨牽張過程中BMMSCs的遷移機制提供實驗依據(jù),并為提高DO的臨床效能提供理論支撐。本課題分為3個部分:第一部分牽張應力下BMMSCs應力相關信號分子的表達目的:探索BMMSCs在牽張應力下表達顯著的應力相關信號分子。方法:1.1體外應用Flexcell 4000T系統(tǒng)對BMMSCs施加牽張力,根據(jù)對BMMSCs加力的不同,分為四組:對照組(不施加牽張力);對BMMSCs施加0.5%牽張力,持續(xù)4h;對BMMSCs施加6%的牽張力,持續(xù)4h;對BMMSCs施加10%的牽張力,持續(xù)4h。加力后,采用實時定量PCR檢測目的分子p38、ERK1/2、MMPs(包括MMP2、MMP9和MMP13)、m TOR以及m TOR信號通路相關分子Raptor、p70S6K基因的表達。1.2將12只SD大鼠隨機分為兩組。在所有動物右側下頜骨植入牽張器。延遲5天后,對其中一組大鼠下頜骨施行牽引(0.2mm/12h,牽引10天);另一組大鼠不進行牽張。兩組大鼠均于術后15天處死,取術區(qū)下頜骨,EDTA脫鈣、石蠟包埋,制作骨組織切片。進行Nestin以及p-p38免疫熒光雙染。結果:結果顯示,各加力組BMMSCs中p38、m TOR、Raptor、p70S6K、MMP2、MMP9和MMP13基因表達均較對照組BMMSCs上調(P0.05),然而ERK1及ERK2的基因表達沒有明顯變化。p38的表達變化較m TOR更為顯著。BMMSCs在6%的牽張應力下,p38、m TOR等基因的表達最為明顯。牽張組大鼠骨截斷部位的Nestin+/p-p38+細胞數(shù)目顯著高于對照組(P0.05)。結論:牽張應力下,p38及m TOR信號分子的表達升高。P38、m TOR信號通路可能參與BMMSCs的生物力學反應。p38信號通路可能發(fā)揮更為重要的作用。第二部分、牽張應力調控BMMSCs遷移能力的分子通路研究目的:探索體內(nèi)、體外牽張應力對BMMSCs遷移能力的影響及參與調控的相關分子通路。方法:2.1使用Flexcell系統(tǒng)對BMMSCs施加牽張力(6%,4h),使用劃痕實驗以及Transwell遷移實驗,檢驗牽張應力下,BMMSCs遷移能力的變化;2.2取第三代BMMSCs細胞,分為四組,分別進行如下處理:(A)應用SB203580(p38的磷酸化抑制劑)處理(20μM,2小時)后,施加牽張力(6%,4h);(B)僅進行牽張加力(6%,4h),不進行SB203580處理;(C)體外不進行牽張加力,但培養(yǎng)液中加入SB203580(20μM)預處理2小時;(D)對照組,不進行加力及SB203580預處理。將上述各組中BMMSCs移入Transwell小室上室中,并計數(shù)12小時后上室基底部細胞數(shù);2.3取第三代BMMSCs細胞,分組及處理方法同2.2。提取各組BMMSCs蛋白,運用Western Blot檢測各組BMMSCs p-p38、p38及MMP-2蛋白的表達;2.4取24只雄性SD大鼠,隨機分為A、B、C三組。將牽張器植入各組大鼠右側下頜骨。5天后進行牽引(0.2mm/12h,連續(xù)牽引10天)。其中A組大鼠自下頜骨牽張第一天起,于術區(qū)局部以2.5mg/kg,每天注射200μL p38激動劑Anisomycin,直至骨牽張結束;B組大鼠于牽張期每天注射200μL濃度為2.5mg/kg的p38抑制劑SB203580,C組于術區(qū)每天注射200μL的DMSO。術后15天取材:處死大鼠,取右側下頜骨,分離骨周軟組織,EDTA脫鈣、包埋、切片,進行Nestin免疫組織化學染色;結果:劃痕實驗結果顯示,牽張加力組BMMSCs較對照組48h后移動距離更遠(P0.05);我們發(fā)現(xiàn),12小時后加力組穿Transwell上室基底膜的BMMSCs細胞數(shù)量高于對照組(P0.05);對BMMSCs使用SB203580處理可以明顯抑制BMMSCs在張應力下的遷移;Western Blot結果顯示:牽張后,BMMSCs的p-p38表達升高(P0.05),而應用SB203580明顯能抑制牽張應力下p-p38在BMMSCs中表達的升高;使用Nestin免疫組化染色,我們發(fā)現(xiàn)應用Anisomycin的大鼠骨截斷區(qū)Nestin+細胞數(shù)目為各組中最多,而應用SB203580者Nestin+細胞數(shù)目最少。結論:牽張應力下p38信號分子的激活促進BMMSCs的遷移。P38介導牽張應力促BMMSCs遷移能力可能通過調控BMMSCs中MMP-2的表達而實現(xiàn)。第三部分干預p38信號通路對DO成骨的影響目的:探索通過干預p38信號通路的方法,以促進DO成骨能力。方法:實驗分組及干預同2.4。大鼠牽張器固定2周后,取材,分別進行組織學染色及Micro CT分析。結果:組織學及Micro CT結果均顯示,各組下頜骨骨痂區(qū)均有新骨生成。應用p38激動劑Anisomycin組,大鼠下頜骨痂區(qū)的新骨生成質量明顯高于SB203580組(P0.05)以及對照組(P0.05);而應用p38抑制劑SB203580組大鼠下頜骨痂區(qū)的新骨生成量低于對照組(P0.05)。結論:在大鼠下頜骨DO局部應用p38激動劑能夠促進新生骨痂的骨再生,這可能是通過促進體內(nèi)BMMSCs的遷移能力實現(xiàn)的。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R782.2
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本文編號：1352713