本文關鍵詞：硝苯地平刺激的人牙齦成纖維細胞中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2的表達及作用

  更多相關文章： 硝苯地平 人牙齦成纖維細胞 肌成纖維細胞 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2 鈣離子

【摘要】：背景及目的藥物性牙齦增生(Drug-induced gingival overgrowth,DGO)是因長期服用抗癲癇藥、鈣離子通道阻滯劑或免疫抑制劑引起的病理性的牙齦體積肥大,以牙齦成纖維細胞的增生及細胞外基質(zhì)堆積為特點。目前其發(fā)病的分子機制尚未完全闡明,因而缺乏有效的藥物治療。近年來,轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(Transglutaminase 2,TG2)因作為信號分子參與纖維化病變的發(fā)生和發(fā)展而備受關注。已有研究發(fā)現(xiàn)鈣離子拮抗劑硝苯地平(Nifedipine,NIF)刺激的大鼠牙齦組織中TG2的表達水平及活性明顯升高,因此本研究體外條件下用NIF刺激人牙齦成纖維細胞,通過檢測NIF作用過程中TG2表達、活性及相關因子的表達,以確定TG2在藥物性牙齦增生中的作用,為探索以TG2為靶點的藥物治療提供一定的理論支持。實驗方法1、采集臨床上健康的成人牙齦,用酶消化聯(lián)合組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)人牙齦成纖維細胞；免疫化學方法進行牙齦成纖維細胞鑒定。2、運用MTT法繪制人牙齦成纖維細胞生長曲線,用第三代人牙齦成纖維細胞,檢測人牙齦成纖維細胞在0μg/ml、0.6μg/ml、0.8μg/ml.1.0μg/ml、1.5μg/ml、 2.0μg/ml濃度的NIF作用24h的增殖情況,以確定NIF的最適刺激濃度。3、流式細胞術檢測人牙齦成纖維細胞在NIF刺激下細胞內(nèi)鈣離子濃度變化。4、微量滴定板技術檢測人牙齦成纖維細胞在1.0 μ g/ml NIF刺激情況下TG2蛋白活性。5、在培養(yǎng)的人牙齦成纖維細胞中同時加入10μg/ml的NIF及0μmol/L.50 μmol/L.100μmol/L.150μmol/L.200μmol/L及250μmol/L濃度的MDC作用24h,用MTT法確定MDC的合適作用濃度.6、根據(jù)以上實驗結(jié)果,將細胞分為以下幾組后,采用Western Blot技術檢測人牙齦成纖維細胞藥物刺激24hTG2及α-SMA蛋白水平的表達。采用Real-time PCR技術檢測人牙齦成纖維細胞藥物刺激24h后TG2及α-SMA基因表達�？瞻讓φ战MC組：DMEMNIF組 A組：DMEM+1.0μg/ml NIFMDC組 B1組：DMEM+1.0μg/ml NIF+50μmol/L MDCB2組：DMEM+1.0μg/ml NIF+100μmol/L MDCB3組：DMEM+1.0μg/ml NIF+150μmol/L MDC7、統(tǒng)計學分析：所有實驗結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件分析,兩獨立組間樣本差異比較用t檢驗,多個獨立樣本的顯著性檢驗運用單因素方差分析,p小于0.05被認定具有統(tǒng)計學意義。實驗結(jié)果一、酶消化聯(lián)合組織塊原代培養(yǎng)法分離培養(yǎng)的人牙齦成纖維細胞,2天左右有細胞從組織塊游出,傳代后在倒置顯微鏡下細胞呈梭形,條索狀、旋渦狀排列,高倍鏡下細胞核呈圓形,核仁清晰。細胞免疫化學法檢測見培養(yǎng)的細胞角蛋白陰性表達,波形蛋白陽性表達。二、MTT結(jié)果顯示：生長曲線發(fā)現(xiàn)24h后人牙齦成纖維細胞生長即進入平臺期。細胞在一定濃度的NIF(0.6-2.0μg/ml)作用下,其增殖能力有不同程度的提高,1μg/ml NIF的促細胞增殖作用最好；將MDC按照50-250 μ mol/L濃度加入1μg/mlNIF刺激的牙齦成纖維細胞中,發(fā)現(xiàn)MDC抑制成纖維細胞增殖,且具有濃度依賴性,100μmol/L MDC的抑制效果最佳,與空白對照組差異明顯(p0.05)發(fā)現(xiàn)MDC在50-150μmol/L范圍內(nèi)抑制成纖維細胞增殖,對細胞形態(tài)無明顯影響,200 u mol/LMDC具有明顯的細胞殺傷作用,細胞生長增殖受到明顯抑制。三、流式細胞術檢測結(jié)果顯示,空白對照組細胞鈣離子熒光含量為6815±79.02,而加入NIF刺激后鈣離子熒光含量明顯增加至11926±131.64。四、微量滴定板法檢測加入NIF刺激前后牙齦成纖維細胞內(nèi)TG2的蛋白活性,結(jié)果顯示空白對照組OD值為0.13±0.05,而加入硝苯地平后的0D值為0.334±O.12,有統(tǒng)計學意義(p0.05)。五.Western Blot顯示1μg/ml NIF作用人牙齦成纖維細胞后,TG2及α-SMA的表達水平均明顯高于空白對照組,加入梯度濃度MDC作用后,TG2及α-SMA蛋白的表達隨MDC濃度增高逐漸降低,顯著低于NIF組。六、Real-time PCR顯示：NIF作用后人牙齦成纖維細胞中TG2的m-RNA較空白對照組明顯增高,加入MDC后,TG2的m-RNA表達水平降低,且隨MDC濃度增高其下降更加明顯。在加入NIF刺激后,α-SMA的m-RNA表達水平增高近5倍,加入50μ mol/L濃度的MDC后,α-SMA的m-RNA水平較NIF刺激組明顯降低,但隨著MDC濃度的增加,α-SMA的m-RNA水平變化不大。結(jié)論1.本實驗研究表明一定濃度范圍的硝苯地平在體外條件下可以促進人牙齦成纖維細胞的增殖。從而提示藥物性牙齦增生的發(fā)病可能與鈣離子拮抗劑促進牙齦成纖維細胞增殖有關。2.硝苯地平刺激后,人牙齦成纖維細胞內(nèi)游離鈣離子濃度明顯升高,這可能是硝苯地平導致牙齦增生的啟動點。3.在藥物性牙齦增生發(fā)病過程中,鈣離子依賴的TG2表達增加,酶活性增強,并且促使牙齦成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化,其抑制劑可顯著降低TG2的上述作用,表明TG2在牙齦增生發(fā)病機制中具有重要作用,提示TG2可作為藥物性牙齦增生疾病的藥物治療靶點。
【關鍵詞】：硝苯地平 人牙齦成纖維細胞 肌成纖維細胞 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2 鈣離子
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R781.4
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 中英文縮略語表13-14
• 前言14-18
• 材料和方法18-24
• 結(jié)果24-26
• 附圖26-32
• 討論32-36
• 全文結(jié)論36-37
• 參考文獻37-41
• 致謝41-42
• 附件42

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1 王勤濤,張玉梅,袁乃梅,黃明霞;人牙齦成纖維細胞體外降解膠原能力的測定[J];牙體牙髓牙周病學雜志;2003年02期

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3 趙永康,武志強,艾紅軍,李述軍,鄭彩云;鈦合金對牙齦成纖維細胞生物學行為的影響[J];實用口腔醫(yī)學雜志;2005年05期

4 唐昊U，

本文編號：1118488