本文關(guān)鍵詞：硝苯地平刺激的人牙齦成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2的表達(dá)及作用

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【摘要】：背景及目的藥物性牙齦增生(Drug-induced gingival overgrowth,DGO)是因長期服用抗癲癇藥、鈣離子通道阻滯劑或免疫抑制劑引起的病理性的牙齦體積肥大,以牙齦成纖維細(xì)胞的增生及細(xì)胞外基質(zhì)堆積為特點(diǎn)。目前其發(fā)病的分子機(jī)制尚未完全闡明,因而缺乏有效的藥物治療。近年來,轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(Transglutaminase 2,TG2)因作為信號(hào)分子參與纖維化病變的發(fā)生和發(fā)展而備受關(guān)注。已有研究發(fā)現(xiàn)鈣離子拮抗劑硝苯地平(Nifedipine,NIF)刺激的大鼠牙齦組織中TG2的表達(dá)水平及活性明顯升高,因此本研究體外條件下用NIF刺激人牙齦成纖維細(xì)胞,通過檢測(cè)NIF作用過程中TG2表達(dá)、活性及相關(guān)因子的表達(dá),以確定TG2在藥物性牙齦增生中的作用,為探索以TG2為靶點(diǎn)的藥物治療提供一定的理論支持。實(shí)驗(yàn)方法1、采集臨床上健康的成人牙齦,用酶消化聯(lián)合組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞；免疫化學(xué)方法進(jìn)行牙齦成纖維細(xì)胞鑒定。2、運(yùn)用MTT法繪制人牙齦成纖維細(xì)胞生長曲線,用第三代人牙齦成纖維細(xì)胞,檢測(cè)人牙齦成纖維細(xì)胞在0μg/ml、0.6μg/ml、0.8μg/ml.1.0μg/ml、1.5μg/ml、 2.0μg/ml濃度的NIF作用24h的增殖情況,以確定NIF的最適刺激濃度。3、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人牙齦成纖維細(xì)胞在NIF刺激下細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。4、微量滴定板技術(shù)檢測(cè)人牙齦成纖維細(xì)胞在1.0 μ g/ml NIF刺激情況下TG2蛋白活性。5、在培養(yǎng)的人牙齦成纖維細(xì)胞中同時(shí)加入10μg/ml的NIF及0μmol/L.50 μmol/L.100μmol/L.150μmol/L.200μmol/L及250μmol/L濃度的MDC作用24h,用MTT法確定MDC的合適作用濃度.6、根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將細(xì)胞分為以下幾組后,采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)人牙齦成纖維細(xì)胞藥物刺激24hTG2及α-SMA蛋白水平的表達(dá)。采用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)人牙齦成纖維細(xì)胞藥物刺激24h后TG2及α-SMA基因表達(dá)�？瞻讓�(duì)照組C組：DMEMNIF組 A組：DMEM+1.0μg/ml NIFMDC組 B1組：DMEM+1.0μg/ml NIF+50μmol/L MDCB2組：DMEM+1.0μg/ml NIF+100μmol/L MDCB3組：DMEM+1.0μg/ml NIF+150μmol/L MDC7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析,兩獨(dú)立組間樣本差異比較用t檢驗(yàn),多個(gè)獨(dú)立樣本的顯著性檢驗(yàn)運(yùn)用單因素方差分析,p小于0.05被認(rèn)定具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果一、酶消化聯(lián)合組織塊原代培養(yǎng)法分離培養(yǎng)的人牙齦成纖維細(xì)胞,2天左右有細(xì)胞從組織塊游出,傳代后在倒置顯微鏡下細(xì)胞呈梭形,條索狀、旋渦狀排列,高倍鏡下細(xì)胞核呈圓形,核仁清晰。細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)見培養(yǎng)的細(xì)胞角蛋白陰性表達(dá),波形蛋白陽性表達(dá)。二、MTT結(jié)果顯示：生長曲線發(fā)現(xiàn)24h后人牙齦成纖維細(xì)胞生長即進(jìn)入平臺(tái)期。細(xì)胞在一定濃度的NIF(0.6-2.0μg/ml)作用下,其增殖能力有不同程度的提高,1μg/ml NIF的促細(xì)胞增殖作用最好；將MDC按照50-250 μ mol/L濃度加入1μg/mlNIF刺激的牙齦成纖維細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)MDC抑制成纖維細(xì)胞增殖,且具有濃度依賴性,100μmol/L MDC的抑制效果最佳,與空白對(duì)照組差異明顯(p0.05)發(fā)現(xiàn)MDC在50-150μmol/L范圍內(nèi)抑制成纖維細(xì)胞增殖,對(duì)細(xì)胞形態(tài)無明顯影響,200 u mol/LMDC具有明顯的細(xì)胞殺傷作用,細(xì)胞生長增殖受到明顯抑制。三、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,空白對(duì)照組細(xì)胞鈣離子熒光含量為6815±79.02,而加入NIF刺激后鈣離子熒光含量明顯增加至11926±131.64。四、微量滴定板法檢測(cè)加入NIF刺激前后牙齦成纖維細(xì)胞內(nèi)TG2的蛋白活性,結(jié)果顯示空白對(duì)照組OD值為0.13±0.05,而加入硝苯地平后的0D值為0.334±O.12,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。五.Western Blot顯示1μg/ml NIF作用人牙齦成纖維細(xì)胞后,TG2及α-SMA的表達(dá)水平均明顯高于空白對(duì)照組,加入梯度濃度MDC作用后,TG2及α-SMA蛋白的表達(dá)隨MDC濃度增高逐漸降低,顯著低于NIF組。六、Real-time PCR顯示：NIF作用后人牙齦成纖維細(xì)胞中TG2的m-RNA較空白對(duì)照組明顯增高,加入MDC后,TG2的m-RNA表達(dá)水平降低,且隨MDC濃度增高其下降更加明顯。在加入NIF刺激后,α-SMA的m-RNA表達(dá)水平增高近5倍,加入50μ mol/L濃度的MDC后,α-SMA的m-RNA水平較NIF刺激組明顯降低,但隨著MDC濃度的增加,α-SMA的m-RNA水平變化不大。結(jié)論1.本實(shí)驗(yàn)研究表明一定濃度范圍的硝苯地平在體外條件下可以促進(jìn)人牙齦成纖維細(xì)胞的增殖。從而提示藥物性牙齦增生的發(fā)病可能與鈣離子拮抗劑促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞增殖有關(guān)。2.硝苯地平刺激后,人牙齦成纖維細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度明顯升高,這可能是硝苯地平導(dǎo)致牙齦增生的啟動(dòng)點(diǎn)。3.在藥物性牙齦增生發(fā)病過程中,鈣離子依賴的TG2表達(dá)增加,酶活性增強(qiáng),并且促使牙齦成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,其抑制劑可顯著降低TG2的上述作用,表明TG2在牙齦增生發(fā)病機(jī)制中具有重要作用,提示TG2可作為藥物性牙齦增生疾病的藥物治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：硝苯地平 人牙齦成纖維細(xì)胞 肌成纖維細(xì)胞 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2 鈣離子
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R781.4
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 中英文縮略語表13-14
• 前言14-18
• 材料和方法18-24
• 結(jié)果24-26
• 附圖26-32
• 討論32-36
• 全文結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-41
• 致謝41-42
• 附件42

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王勤濤,張玉梅,袁乃梅,黃明霞;人牙齦成纖維細(xì)胞體外降解膠原能力的測(cè)定[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2003年02期

2 徐燕,袁萍,李頌,胡勇,王明麗;尼古丁和煙草浸提液對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞生長和貼附能力的影響[J];口腔醫(yī)學(xué)研究;2004年01期

3 趙永康,武志強(qiáng),艾紅軍,李述軍,鄭彩云;鈦合金對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J];實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志;2005年05期

4 唐昊U，

本文編號(hào)：1118488