本文關(guān)鍵詞：牙齦素通過(guò)C5a途徑抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1表型極化

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【摘要】：背景： 牙周炎是一種慢性感染性疾病，其發(fā)生發(fā)展涉及一系列的免疫炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞雖然在免疫炎癥反應(yīng)中起了重要作用，，但在組織破壞和骨吸收中也起到了不可忽視的作用，同時(shí)也在組織修復(fù)與重建中扮演重要角色，這一現(xiàn)象與巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞在不同微環(huán)境的誘導(dǎo)下，可被極化為M1和M2型巨噬細(xì)胞，M1和M2型巨噬細(xì)胞分別發(fā)揮不同的促炎和抗炎作用。M1型巨噬細(xì)胞的主要特征為IL-12、IL-23、NO的高表達(dá)與IL-10的低表達(dá)；M2型巨噬細(xì)胞的主要特征為IL-12、IL-23、NO的低表達(dá)與IL-10、Arg-1的高表達(dá)。 牙齦卟啉單胞菌是牙周炎重要的致病菌之一，與牙周炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。該菌具有一系列逃避宿主防御機(jī)制及破壞宿主組織的毒力因子，包括牙齦素（gingipains）、脂多糖、菌毛和莢膜，他們影響組織細(xì)胞多種炎性介質(zhì)的表達(dá)。目前文獻(xiàn)對(duì)于LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化方面研究甚多，但關(guān)于牙齦素對(duì)于巨噬細(xì)胞極化方面的研究未見相關(guān)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)嘗試在體外將LPS與牙齦素分別或共同作用于小鼠巨噬細(xì)胞后，研究其對(duì)巨噬細(xì)胞的極化影響，以期在巨噬細(xì)胞極化這一新角度，探索牙周炎治療的新靶點(diǎn)。 方法： 1.牙齦素的制備： 丙酮沉淀P.g ATCC33277菌培養(yǎng)物上清，經(jīng)重懸、透析提取牙齦素，以BAPNA為底物測(cè)定牙齦素活性，以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)鑒定提取牙齦素純度及分子量。 2.實(shí)驗(yàn)分組： 實(shí)驗(yàn)共分為5組： 第一組：巨噬細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組（空白對(duì)照組）； 第二組：LPS（1μg/ml）與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組； 第三組：牙齦素（4U/L）與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組； 第四組：LPS（1μg/ml）、牙齦素（4U/L）與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組； 第五組：LPS（1μg/ml）、牙齦素（4U/L）、C5aRA(C5a受體拮抗劑，1mmol/L)與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組。 3.巨噬細(xì)胞極化表型標(biāo)志的檢測(cè)： 上述各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，通過(guò)Realtime-PCR和ELISA方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化表型標(biāo)志IL-10、IL-12、IL-23、NO在基因和蛋白水平的表達(dá)。 結(jié)果: 1.P.g ATCC33277牙齦素提取物經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出單一50kDa蛋白條帶，主要為Rgp，底物發(fā)色法測(cè)定提取物活性值為16.70U／L。 2.Realtime-PCR和ELISA結(jié)果顯示，LPS組IL-12、IL-23、NO表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增加（P＜0.05），LPS+牙齦素組IL-12、IL-23、NO表達(dá)較LPS組明顯降低（P＜0.05），LPS+牙齦素+C5a受體拮抗劑組IL-12、IL-23、NO表達(dá)較LPS+牙齦素組明顯增高（P＜0.05），各組IL-10的表達(dá)變化并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)論： 1.丙酮沉淀法可提取分子量50kDa Rgp； 2.在體外LPS可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M1表型極化； 3.牙齦素可抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1表型極化； 4.牙齦素通過(guò)C5a途徑抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1表型極化。
【關(guān)鍵詞】：牙齦卟啉單胞菌 牙齦素 脂多糖 巨噬細(xì)胞 極化
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R781.4
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• abstract6-10
• 英文縮略詞表10-12
• 第1章 緒論12-18
• 1.1 前言12
• 1.2 文獻(xiàn)綜述12-18
• 1.2.1 巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制12-14
• 1.2.2 巨噬細(xì)胞極化的表型特征14-15
• 1.2.3 牙齦卟啉單胞菌牙齦素與巨噬細(xì)胞極化15-16
• 1.2.4 巨噬細(xì)胞極化在牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用16-18
• 第2章 材料與方法18-27
• 2.1 材料18-21
• 2.1.1 主要試劑和儀器18-19
• 2.1.2 試劑配制19-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-27
• 2.2.1 牙齦素的提取21
• 2.2.2 牙齦素的鑒定21-23
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)分組23-24
• 2.2.4 Realtime-PCR 檢測(cè)基因的表達(dá)24-25
• 2.2.5 ELISA 檢測(cè)蛋白的表達(dá)25-26
• 2.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析26-27
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-34
• 3.1 SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果27
• 3.2 牙齦素活性測(cè)定結(jié)果27-28
• 3.3 Realtime PCR 結(jié)果28-31
• 3.3.1 Realtime PCR 檢測(cè) IL-12 mRNA 表達(dá)（圖 3.4）28-29
• 3.3.2 Realtime PCR 檢測(cè) IL-23 mRNA 表達(dá)（圖 3.5）29-30
• 3.3.3 Realtime PCR 檢測(cè) iNOS mRNA 表達(dá)（圖 3.6）30
• 3.3.4 Realtime PCR 檢測(cè) iNOS mRNA 表達(dá)（圖 3.7）30-31
• 3.4 ELISA 檢測(cè)結(jié)果31-34
• 3.4.1 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液 IL-12 的含量（圖 3.8）31
• 3.4.2 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液 IL-23 的含量（圖 3.9）31-32
• 3.4.3 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液 NO 的含量（圖 3.10）32-33
• 3.4.4 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液 IL-10 的含量（圖 3.11）33-34
• 第4章 討論34-38
• 第5章 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-41
• 作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間所取得的科研成果41-42
• 致謝42

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