本文關(guān)鍵詞：NFκB上調(diào)SET基因的表達(dá)及其分子機(jī)制研究

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【摘要】：目的:在阿爾茲海默病和唐氏綜合癥患者的大腦中發(fā)現(xiàn)SET蛋白的升高,并滯留于神經(jīng)元的細(xì)胞漿中。胞質(zhì)滯留的SET蛋白會(huì)引起蛋白磷酸酶2A的抑制,最終促進(jìn)了阿爾茲海默病中tau蛋白的病理進(jìn)展。本研究以人類SET基因?yàn)檠芯繉?duì)象,主要研究核轉(zhuǎn)錄因子NFκB對(duì)SET基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其分子機(jī)制。材料和方法:5’-RACE,熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建,細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染,熒光素酶活性檢測(cè)及結(jié)果分析,核蛋白提取,電泳遷移率分析,RT-PCR結(jié)果:1.用5’-RACE方法和基因特異性擴(kuò)增技術(shù)獲得一長(zhǎng)約200bp核酸片段,克隆進(jìn)pc DNA4/myc-His載體,測(cè)序分析結(jié)果顯示與外源寡聚核苷酸序列相接的首個(gè)堿基為SET基因翻譯起始位點(diǎn)(ATG)上游123bp處的胞嘧啶C。2.擴(kuò)增SET基因啟動(dòng)子區(qū)-1276至+123共1399bp區(qū)域內(nèi)不同長(zhǎng)度序列,將片段插入載體p GL3-basic構(gòu)建重組熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒p SET-A至p SET-I共9個(gè)。熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示p SET-C(-483/+123)的相對(duì)熒光素酶活性為(131.75±9.87RLU)。3.轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)分析提示SET基因啟動(dòng)子-483/+123區(qū)域共有8個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。8個(gè)位點(diǎn)分別突變后檢測(cè)熒光素酶活性提示靠近+123端的2個(gè)SP1和1個(gè)NFκB突變后啟動(dòng)子活性明顯下降。4.質(zhì)粒p SET-C和p MTF-p65或p CGN-Sp1共轉(zhuǎn)染,結(jié)果顯示在HEK293細(xì)胞系中熒光素酶活性分別提高了1.92倍(p0.0001)或1.47倍(p0.05),在SH-SY5Y細(xì)胞系中p MTF-p65提高了熒光素酶活性1.37倍(p0.05)而SP1無(wú)影響。在SH-SY5Y細(xì)胞系中,缺乏NF?B結(jié)合位點(diǎn)的p SET-F、p SET-G和含有突變NFκB結(jié)合位點(diǎn)的p SET-C MH與p MTF-p65共轉(zhuǎn)后熒光素酶活性無(wú)升高。5.電泳遷移率分析提示人類SET基因啟動(dòng)子+107至+116bp為一個(gè)具有功能活性的NF?B結(jié)合位點(diǎn)。6.過(guò)表達(dá)或活化NF?B在HEK293細(xì)胞系中對(duì)SET基因m RNA水平無(wú)顯著影響。在SH-SY5Y細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)或活化NF?B可分別增加SET蛋白亞型1的m RNA水平56.94%或73.70%,對(duì)亞型2的m RNA水平無(wú)顯著影響。結(jié)論:1.人類SET基因主要的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為其翻譯起始位點(diǎn)ATG上游123bp處的胞嘧啶C。2.人類SET基因-483至+123片段具有顯著啟動(dòng)子活性,為SET基因功能啟動(dòng)子區(qū)。3.核轉(zhuǎn)錄因子NFκB能提高人類SET基因啟動(dòng)子活性。4.人類SET基因有復(fù)雜且精確的調(diào)控機(jī)制,NFκB能與其啟動(dòng)子有效結(jié)合。5.核轉(zhuǎn)錄因子NFκB能上調(diào)人類SET蛋白亞型1的轉(zhuǎn)錄水平,對(duì)亞型2無(wú)影響,提示2種亞型具有不同的調(diào)控方式。目的:初步探討棉鼠肺表面活性蛋白D(Surfactant-associated protein D,SP-D)核苷酸和氨基酸序列與其他物種間的同源性和交叉反應(yīng)性,觀察SP-D m RNA水平和SP-D蛋白在棉鼠肺損傷模型中的表達(dá)規(guī)律,為探究呼吸道疾病發(fā)病機(jī)制提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料和方法:SPF級(jí)棉鼠32只隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)實(shí)驗(yàn)組(實(shí)驗(yàn)組再按給藥后24、48和96h分為3個(gè)亞組,每組8只)。實(shí)驗(yàn)組采用腹腔注射給予2mg/kg的脂多糖,對(duì)照組給予相當(dāng)劑量的生理鹽水。提取棉鼠肺總RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增SP-D基因并克隆測(cè)序,采用生物信息學(xué)軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析;HE染色觀察各組棉鼠肺組織病理學(xué)變化;q RT-PCR檢測(cè)SP-D m RNA水平;Western blot檢測(cè)SP-D蛋白表達(dá)。結(jié)果:棉鼠SP-D基因開放閱讀框含1113bp,編碼370個(gè)氨基酸,與部分已知其他物種SP-D核苷酸和氨基酸序列同源性分別在75.64%-90.01%和72.68%-88.56%之間;在SP-D基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹上,棉鼠與其他嚙齒類動(dòng)物形成一個(gè)獨(dú)特的分支;與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組肺組織病理特征性變化隨LPS刺激時(shí)間延長(zhǎng)而加劇;SP-D m RNA水平和SP-D蛋白表達(dá)水平隨LPS處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加,在LPS處理24h后,SP-D m RNA水平和SP-D蛋白表達(dá)開始明顯增加并出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),48h時(shí)后SP-D m RNA水平和SP-D蛋白表達(dá)水平均增加到峰值,96h后兩者仍保持較高水平,與對(duì)照組相比具有極顯著性差異(P0.01)。結(jié)論:棉鼠SP-D核苷酸和氨基酸序列與其他物種間具有較高同源性,且棉鼠和其他物種SP-D蛋白間存在交叉反應(yīng)性;棉鼠SP-D m RNA水平和SP-D蛋白表達(dá)水平在肺損傷模型中均存在時(shí)間依賴性,可作為判斷肺損傷疾病不同發(fā)展階段的生物標(biāo)記。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茲海默病 SET NFκB Sp1 轉(zhuǎn)錄 棉鼠 肺表面活性蛋白D 克隆 表達(dá) 脂多糖
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照4-5
• 中文摘要5-10
• 英文摘要10-15
• 第一部分 NFκB上調(diào)SET基因的表達(dá)及其分子機(jī)制研究15-42
• 前言15-16
• 1 材料與方法16-31
• 2 結(jié)果31-37
• 3 討論與總結(jié)37-39
• 參考文獻(xiàn)39-42
• 第二部分 棉鼠SP-D基因的克隆及其在LPS誘導(dǎo)肺損傷模型中的表達(dá)分析42-55
• 前言42
• 1 材料與方法42-45
• 2 結(jié)果45-50
• 3 討論50-53
• 參考文獻(xiàn)53-55
• 文獻(xiàn)綜述55-67
• 參考文獻(xiàn)62-67
• 致謝67-68
• 攻讀碩士研究生期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文68

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本文編號(hào)：894648