本文關(guān)鍵詞：NFκB上調(diào)SET基因的表達及其分子機制研究

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【摘要】：目的:在阿爾茲海默病和唐氏綜合癥患者的大腦中發(fā)現(xiàn)SET蛋白的升高,并滯留于神經(jīng)元的細胞漿中。胞質(zhì)滯留的SET蛋白會引起蛋白磷酸酶2A的抑制,最終促進了阿爾茲海默病中tau蛋白的病理進展。本研究以人類SET基因為研究對象,主要研究核轉(zhuǎn)錄因子NFκB對SET基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其分子機制。材料和方法:5’-RACE,熒光素酶報告基因質(zhì)粒構(gòu)建,細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染,熒光素酶活性檢測及結(jié)果分析,核蛋白提取,電泳遷移率分析,RT-PCR結(jié)果:1.用5’-RACE方法和基因特異性擴增技術(shù)獲得一長約200bp核酸片段,克隆進pc DNA4/myc-His載體,測序分析結(jié)果顯示與外源寡聚核苷酸序列相接的首個堿基為SET基因翻譯起始位點(ATG)上游123bp處的胞嘧啶C。2.擴增SET基因啟動子區(qū)-1276至+123共1399bp區(qū)域內(nèi)不同長度序列,將片段插入載體p GL3-basic構(gòu)建重組熒光素酶報告基因質(zhì)粒p SET-A至p SET-I共9個。熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示p SET-C(-483/+123)的相對熒光素酶活性為(131.75±9.87RLU)。3.轉(zhuǎn)錄因子預測分析提示SET基因啟動子-483/+123區(qū)域共有8個核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。8個位點分別突變后檢測熒光素酶活性提示靠近+123端的2個SP1和1個NFκB突變后啟動子活性明顯下降。4.質(zhì)粒p SET-C和p MTF-p65或p CGN-Sp1共轉(zhuǎn)染,結(jié)果顯示在HEK293細胞系中熒光素酶活性分別提高了1.92倍(p0.0001)或1.47倍(p0.05),在SH-SY5Y細胞系中p MTF-p65提高了熒光素酶活性1.37倍(p0.05)而SP1無影響。在SH-SY5Y細胞系中,缺乏NF?B結(jié)合位點的p SET-F、p SET-G和含有突變NFκB結(jié)合位點的p SET-C MH與p MTF-p65共轉(zhuǎn)后熒光素酶活性無升高。5.電泳遷移率分析提示人類SET基因啟動子+107至+116bp為一個具有功能活性的NF?B結(jié)合位點。6.過表達或活化NF?B在HEK293細胞系中對SET基因m RNA水平無顯著影響。在SH-SY5Y細胞中,過表達或活化NF?B可分別增加SET蛋白亞型1的m RNA水平56.94%或73.70%,對亞型2的m RNA水平無顯著影響。結(jié)論:1.人類SET基因主要的轉(zhuǎn)錄起始位點為其翻譯起始位點ATG上游123bp處的胞嘧啶C。2.人類SET基因-483至+123片段具有顯著啟動子活性,為SET基因功能啟動子區(qū)。3.核轉(zhuǎn)錄因子NFκB能提高人類SET基因啟動子活性。4.人類SET基因有復雜且精確的調(diào)控機制,NFκB能與其啟動子有效結(jié)合。5.核轉(zhuǎn)錄因子NFκB能上調(diào)人類SET蛋白亞型1的轉(zhuǎn)錄水平,對亞型2無影響,提示2種亞型具有不同的調(diào)控方式。目的:初步探討棉鼠肺表面活性蛋白D(Surfactant-associated protein D,SP-D)核苷酸和氨基酸序列與其他物種間的同源性和交叉反應(yīng)性,觀察SP-D m RNA水平和SP-D蛋白在棉鼠肺損傷模型中的表達規(guī)律,為探究呼吸道疾病發(fā)病機制提供科學的實驗依據(jù)。材料和方法:SPF級棉鼠32只隨機分為生理鹽水對照組和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)實驗組(實驗組再按給藥后24、48和96h分為3個亞組,每組8只)。實驗組采用腹腔注射給予2mg/kg的脂多糖,對照組給予相當劑量的生理鹽水。提取棉鼠肺總RNA,經(jīng)RT-PCR擴增SP-D基因并克隆測序,采用生物信息學軟件對測序結(jié)果進行同源性和系統(tǒng)進化分析;HE染色觀察各組棉鼠肺組織病理學變化;q RT-PCR檢測SP-D m RNA水平;Western blot檢測SP-D蛋白表達。結(jié)果:棉鼠SP-D基因開放閱讀框含1113bp,編碼370個氨基酸,與部分已知其他物種SP-D核苷酸和氨基酸序列同源性分別在75.64%-90.01%和72.68%-88.56%之間;在SP-D基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹上,棉鼠與其他嚙齒類動物形成一個獨特的分支;與對照組相比,實驗組肺組織病理特征性變化隨LPS刺激時間延長而加劇;SP-D m RNA水平和SP-D蛋白表達水平隨LPS處理時間的延長而逐漸增加,在LPS處理24h后,SP-D m RNA水平和SP-D蛋白表達開始明顯增加并出現(xiàn)統(tǒng)計學差異(P0.05),48h時后SP-D m RNA水平和SP-D蛋白表達水平均增加到峰值,96h后兩者仍保持較高水平,與對照組相比具有極顯著性差異(P0.01)。結(jié)論:棉鼠SP-D核苷酸和氨基酸序列與其他物種間具有較高同源性,且棉鼠和其他物種SP-D蛋白間存在交叉反應(yīng)性;棉鼠SP-D m RNA水平和SP-D蛋白表達水平在肺損傷模型中均存在時間依賴性,可作為判斷肺損傷疾病不同發(fā)展階段的生物標記。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茲海默病 SET NFκB Sp1 轉(zhuǎn)錄 棉鼠 肺表面活性蛋白D 克隆 表達 脂多糖
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-5
• 中文摘要5-10
• 英文摘要10-15
• 第一部分 NFκB上調(diào)SET基因的表達及其分子機制研究15-42
• 前言15-16
• 1 材料與方法16-31
• 2 結(jié)果31-37
• 3 討論與總結(jié)37-39
• 參考文獻39-42
• 第二部分 棉鼠SP-D基因的克隆及其在LPS誘導肺損傷模型中的表達分析42-55
• 前言42
• 1 材料與方法42-45
• 2 結(jié)果45-50
• 3 討論50-53
• 參考文獻53-55
• 文獻綜述55-67
• 參考文獻62-67
• 致謝67-68
• 攻讀碩士研究生期間發(fā)表的學術(shù)論文68

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本文編號：894648