本文關(guān)鍵詞：RAGE阻斷劑FPS-ZM1對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物所致大鼠腦損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是老年發(fā)病的以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶力減退為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)變性疾病。Tau蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)和Ap異常沉積形成的老年斑是AD典型的病理?yè)p害,另外,自由基損傷和氧化應(yīng)激,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在AD的病理過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。AD的發(fā)病機(jī)制迄今尚不清楚,亦缺少有效的治療方法,故研究其發(fā)病機(jī)制及針對(duì)發(fā)病機(jī)制研究新型抗AD藥物是十分必要的。晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)經(jīng)非酶促糖基化反應(yīng)生成的不可逆的終末產(chǎn)物。隨著年齡增長(zhǎng),體內(nèi)AGEs生成增加,特別是胰島素抵抗及糖尿病患者體內(nèi)AGEs增加更為明顯。AGEs能介導(dǎo)多種病理過(guò)程,近年來(lái)研究顯示,AGEs可能是引起AD等認(rèn)知功能障礙疾病的原因之一。AGEs在AD神經(jīng)元纖維纏結(jié)和老年斑大量聚集,且隨著病情進(jìn)展腦內(nèi)AGEs聚集增多,貫穿整個(gè)AD病程。AGEs一方面通過(guò)直接的毒性作用促進(jìn)蛋白質(zhì)或脂質(zhì)交聯(lián),對(duì)神經(jīng)原纖維纏結(jié)和老年斑進(jìn)行修飾,并誘發(fā)AD早期的炎癥反應(yīng)。另一方面,AGEs還可與其受體(recepter for advanced glycation end products, RAGE)結(jié)合,激活一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與AD的病理過(guò)程。Li等的研究表明AGEs與RAGE結(jié)合誘導(dǎo)磷酸化tau蛋白表達(dá)增加,提示AGEs-RAGE通路與神經(jīng)元纖維纏結(jié)的形成密切相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)顯示,AGEs與RAGE的結(jié)合能夠啟動(dòng)氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞的損傷。由此可見(jiàn),AGEs-RAGE通路通過(guò)多種途徑促進(jìn)AD發(fā)生發(fā)展,在AD發(fā)病過(guò)程中有至關(guān)重要的作用。但是,AGEs如何通過(guò)其受體RAGE影響tau蛋白磷酸化以及導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激迄今為止尚不清楚�；赗AGE在AD中的重要作用,降低RAGE的表達(dá)或者競(jìng)爭(zhēng)性阻斷RAGE與配體的結(jié)合可望成為AD治療的新靶點(diǎn)。目前阻斷RAGE的措施主要有RAGE抗體及sRAGE,但是均不能通過(guò)血腦屏障,不能阻斷腦內(nèi)RAGE與配體的結(jié)合,對(duì)AD的療效受到限制。RAGE阻斷劑TTP488(岜稱為PF-04494700)因其高劑量治療產(chǎn)生的副作用導(dǎo)致臨床實(shí)驗(yàn)終止。因此,研究新的安全有效的阻斷RAGE的藥物具有非常重要的意義。Deane于2012年首次報(bào)道了一種新型小分子RAGE阻斷劑FPS-ZM1,低毒性、高親和力,且有良好的血腦屏障通透性,腹腔給藥通過(guò)抑制腦內(nèi)Ap生成和炎癥反應(yīng)可明顯改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,是一種有臨床應(yīng)用前景的RAGE阻斷劑。我們前期研究發(fā)現(xiàn)FPS-ZM1可以阻斷AGEs-RAGE誘導(dǎo)的腦內(nèi)Ap生成和炎癥反應(yīng),改善大鼠的認(rèn)知功能。但FPS-ZM1的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究,尤其該藥物是否對(duì)AGEs誘導(dǎo)的腦內(nèi)tau蛋白磷酸化、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生影響尚未見(jiàn)報(bào)道。研究目的建立AGEs損傷動(dòng)物模型,研究AGEs-RAGE對(duì)認(rèn)知功能、tau蛋白磷酸化、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響；進(jìn)一步探討FPS-ZM1對(duì)AGEs誘導(dǎo)腦損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。研究方法1.AGEs損傷大鼠模型的建立及分組6-8周齡清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠,隨機(jī)分為4組,正常對(duì)照組(Control), FPS-ZM1對(duì)照組(FZM1), AGEs模型組(AGEs), AGEs+FPS-ZM1干預(yù)組(AGEs+FZM1),每組10只。腦立體定位注射的方法造模,AGEs和AGEs+FZM1組雙側(cè)海馬注射AGE-BSA 5μl, Control和FZM1組注射同等量的生理鹽水。造模前1周開始,FZM1和AGEs+FZM1組每天腹腔注射FPS-ZM1(1mg/kg/d,2ml)共4周,Control和AGEs組每天腹腔注射2m1生理鹽水共4周。2.行為學(xué)檢測(cè)：Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估各組大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。3. Western blot和免疫組化檢測(cè)海馬RAGE蛋白的表達(dá)。4. Western blot檢測(cè)海馬tau蛋白磷酸化水平,Tau-5(總tau),PHF-1 (Phospho-tau at Ser396/404), PT231 (Phospho-tau at Thr231).5. Western blot檢測(cè)海馬Akt和GSK-3β磷酸化水平,t-Akt(total Akt),Ser473-Akt (Phospho-Akt at Ser 473), tGSK-3β (total GSK-3β), S9-GSK3p (Phospho-GSK-3β atSer9)。6.組織活性氧熒光定量(DCFH-DA)法檢測(cè)各組大鼠海馬區(qū)活性氧(ROS)水平；丙二醛(MDA)法檢測(cè)海馬脂質(zhì)過(guò)氧化(lipid peroxidation, LPO)水平；生化方法檢測(cè)各組大鼠海馬超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)的活性或含量。7. Western blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)GRP78, p-PERK, p-eIF2a,CHOP, caspase-12。8.分光光度法測(cè)定細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白酶caspase-3, caspase-9的活性。研究結(jié)果1. Morris水迷宮成績(jī)比較Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)第3天開始,AGEs組大鼠逃避潛伏期較Control組明顯延長(zhǎng)(P0.05),與AGEs組對(duì)比,AGEs+FZM1組逃避潛伏期明顯縮短(P0.05)。AGEs組大鼠穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)和在目標(biāo)象限的時(shí)間較Control組顯著減少(P0.01, P0.01), AGEs+FZM1組大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)和在目標(biāo)象限的時(shí)間較AGEs組明顯增加(P0.01,P0.01)。四組動(dòng)物的游泳速度無(wú)顯著差異。2.各組大鼠海馬組織RAGE蛋白表達(dá)比較Western blot顯示,AGEs組大鼠腦組織RAGE蛋白表達(dá)明顯高于Control組(P0.01), AGEs+FZM1組大鼠腦組織RAGE蛋白表達(dá)較AGEs組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。Control組和FZM1組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。免疫組化顯示,Control組和FZM1組RAGE少量表達(dá),AGEs組RAGE蛋白表達(dá)明顯高于Control組,著色呈棕黃色,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05), AGEs+FZM1組大鼠腦組織RAGE表達(dá)較AGEs組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.各組大鼠海馬組織磷酸化tau蛋白,Akt,GSK3β表達(dá)的比較AGEs組大鼠腦組織PHF-1,PT231蛋白表達(dá)相對(duì)系數(shù)分別為0.87和0.79,是Control組蛋白表達(dá)相對(duì)系數(shù)(0.39,0.27)的2.2倍和2.9倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01, P0.01), AGEs+FZM1組大鼠PHF-1,PT231蛋白表達(dá)相對(duì)系數(shù)(0.38,0.41)較AGEs組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01,P0.01)。AGEs組大鼠腦組織Ser473-Akt和S9-GSK3p蛋白表達(dá)相對(duì)系數(shù)為0.36和0.40,較Control組.(0.72,0.76)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01,P0.01),給予FPS-ZM1干預(yù)后,AGEs+FZM 1組腦組織Ser473-Akt和S9-GSK3p蛋白表達(dá)相對(duì)系數(shù)為0.55和0.61,與AGEs組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01,P0.01),各組大鼠腦組織t-Akt和tGSK-3β蛋白表達(dá)無(wú)差異(P0.05)。4.各組大鼠海馬組織氧化應(yīng)激及抗氧化能力的比較本實(shí)驗(yàn)以ROS、LPO水平評(píng)價(jià)海馬氧化損傷的程度。AGEs組大鼠腦組織ROS和LPO水平較Control組明顯升高(P0.01,P0.01),AGEs+FZM1組大鼠腦組織ROS和LPO水平較AGEs組降低(P0.01,P0.05), AGEs+FZM1組大鼠腦組織ROS和LPO水平仍高于Control組,Control組和FZM1組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。SOD、GPx活性以及GSH含量可間接反映體內(nèi)清除自由基的能力。AGEs組大鼠腦組織SOD和GPx活性較Control組明顯降低(P0.01,P0.01),AGEs+FZM1組大鼠腦組織SOD和GPx活性較AGEs組升高(P0.01,P0.01),AGEs+FZM1組大鼠腦組織SOD和GPx活性仍低于Control組,Control組和FZM1組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。AGEs組大鼠腦組織GSH含量較Control組明顯降低(P0.01),AGEs+FZM1組大鼠腦組織GSH含量較AGEs組升高(P0.05),Control組和FZM1組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。5.各組大鼠海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡相關(guān)因子的比較AGEs組大鼠腦組織GRP78,p-PERK, p-eIF2a蛋白表達(dá)相對(duì)系數(shù)為(0.66,0.69,0.71),是Control組1.9,2.1和1.8倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01,P0.01,P0.01), AGEs+FZM1組腦組織GRP78,p-PERK,p-eIF2a蛋白表達(dá)相對(duì)系數(shù)為(0.44,0.35,0.52),較AGEs組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01,P0.01,P0.05),AGEs+FZM1組蛋白表達(dá)仍高于Control組,Control組和FZM1組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。AGEs組大鼠腦組織CHOP和caspase-12蛋白表達(dá)相對(duì)系數(shù)為0.80和0.74,是Control組(0.38,0.34)的2.1和2.2倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01,P0.01),AGEs+FZM1組腦組織CHOP和caspase-12蛋白表達(dá)相對(duì)系數(shù)為0.59和0.42,較AGEs組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。Control組和FZM1組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。AGEs組大鼠腦組織caspase-3和caspase-9活性分別是Control組的2.6和1.7倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01, P0.01), AGEs+FZM1組腦組織caspase-3和caspase-9活性較AGEs組降分別降低46%和29%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01,P0.01)。Control組和FZM1組之間無(wú)明顯差異(P0.05)。研究結(jié)論1. AGEs海馬注射導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降,FPS-ZM1通過(guò)阻斷RAGE,能夠減輕AGEs誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷,改善認(rèn)知功能。2. AGEs-RAGE導(dǎo)致tau蛋白在多個(gè)AD相關(guān)位點(diǎn)的異常過(guò)度磷酸化,Akt/GSK-3β通路可能參與其中,FPS-ZM1能夠阻斷RAGE,降低GSK-3β的活性和tau蛋白異常磷酸化的水平。3. AGEs與RAGE結(jié)合激活氧化應(yīng)激參與腦損害,FPS-ZM1增強(qiáng)腦組織的抗氧化能力,阻斷AGEs-RAGE介導(dǎo)的氧化應(yīng)激,是其發(fā)揮腦保護(hù)作用的內(nèi)在機(jī)制之一。4. AGEs與RAGE結(jié)合能夠引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,分子伴侶GRP78及信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-PERK和p-eIF2α表達(dá)增高,凋亡相關(guān)因子CHOP和caspase-12活化。FPS-ZM1具有腦保護(hù)作用,通過(guò)阻斷RAGE,下調(diào)GRP78、p-PERK、 p-eIF2α和凋亡相關(guān)因子的表達(dá),有效阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。研究意義RAGE通過(guò)多種途徑促進(jìn)AD的發(fā)生發(fā)展,降低RAGE的表達(dá)水平或者競(jìng)爭(zhēng)性阻斷RAGE與配體的相互作用可望成為延緩AD的治療靶點(diǎn)。由于RAGE抗體及sRAGE難以通過(guò)血腦屏障,使其臨床應(yīng)用受到制約,研究新的小分子阻斷RAGE作用的藥物已成為必然趨勢(shì)。1.本研究以大鼠海馬注射AGEs的方法建立AGEs損傷模型,觀察其對(duì)tau蛋白磷酸化、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響,進(jìn)一步證明AGEs-RAGE通路在AD發(fā)病過(guò)程中有非常重要的作用。2.本研究在AGEs模型中探討FPS-ZM1阻斷RAGE與AGEs結(jié)合的腦保護(hù)作用,發(fā)現(xiàn)該藥物對(duì)AGEs誘導(dǎo)的tau蛋白磷酸化、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)指標(biāo)有明顯的改善作用,提示FPS-ZM1是一種有效的小分子RAGE阻斷劑,可望成為一種有潛力的AD防治藥物。
【關(guān)鍵詞】：晚期糖基化終末產(chǎn)物 阿爾茨海默病 tau 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 FPS-ZM1
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-18
• 符號(hào)說(shuō)明18-20
• 前言20-23
• 實(shí)驗(yàn)材料與方法23-37
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-41
• 討論41-50
• 結(jié)論50-51
• 附圖51-58
• 附表58-60
• 參考文獻(xiàn)60-67
• 綜述67-80
• 參考文獻(xiàn)74-80
• 致謝80-81
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄81-82
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況82-83
• 外文論文183-107
• 外文論文2107-126

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本文編號(hào)：865849