發(fā)布時間：2017-09-13 19:16

  本文關(guān)鍵詞：蜂王漿多肽的制備及其對神經(jīng)細胞保護作用的研究

  更多相關(guān)文章： 主要王漿蛋白1 蜂王漿多肽 阿爾茲海默癥 反相高壓液相色譜 液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)

【摘要】：阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease,AD)是一種以β淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)級聯(lián)假說為主要病因的老年神經(jīng)退行性疾病。蜂王漿對神經(jīng)細胞具有營養(yǎng)和促進細胞分化的作用。主要王漿蛋白1(MRJP1)是主要王漿蛋白家族中含量最高的成員,《Nature》報道指出MRJP1是蜜蜂幼蟲發(fā)育成為蜂王的關(guān)鍵因子。主要王漿蛋白酶解后的蜂王漿多肽(Royal Jelly Peptides,RJP)具有極強的抗氧化和抗衰老的能力。本論文以主要王漿蛋白的主要成分MRJP1為研究目標,探索了主要王漿蛋白1(MRJP1)的分離純化方法,而且首次使用胰蛋白酶酶解主要王漿蛋白1(MRJP1),并以AD的兩種經(jīng)典細胞模型為篩選活性多肽的依據(jù),對具有活性的蜂王漿多肽進行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果如下:首先,本論文以新鮮的蜂王漿為原材料,按一定的比例將蜂王漿與磷酸鹽緩沖液混合,抽提水溶性蜂王漿蛋白,利用Ni柱親和層析、陰離子交換層析等蛋白純化技術(shù)從天然的蜂王漿中分離純化得到MRJP1樣品,經(jīng)過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定該樣品為MRJP1。其次,分離純化得到的MRJP1與胰蛋白酶按質(zhì)量比2:1的比例進行酶解反應(yīng),所得酶解產(chǎn)物,經(jīng)過超濾管超濾,以及反相高壓液相色譜分離制備蜂王漿多肽樣品。再次,以AD的兩種經(jīng)典細胞模型人神經(jīng)瘤母細胞SH-SY5Y及小鼠神經(jīng)瘤母細胞N2a/APP695sw作為篩選活性多肽的依據(jù)。經(jīng)過對多肽樣品進行SH-SY5Y細胞的MTT細胞毒性試驗以及N2a/APP695sw細胞的AβELISA檢測,發(fā)現(xiàn)分子量0-3 kDa的RJP和RP-HPLC得到的C組RJP對細胞具有顯著地保護作用,而且濃度為114.6μg/ml的分子量0-3 kDa的RJP和濃度為11.1μg/ml的C組RJP對細胞具有較高的藥理活性。最后,采用高性能液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)對具有顯著藥理活性的C組RJP進行多肽組成及寡肽的氨基酸序列分析。質(zhì)譜結(jié)果顯示,其多肽組成較復雜。使用mascot軟件檢索ncbi_insecta數(shù)據(jù)庫,匹配到三條寡肽,并得到其氨基酸序列及分子量信息。本研究首次以在蜂王幼蟲的發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用的MRJP1為研究目標,探索其胰蛋白酶酶解產(chǎn)物蜂王漿多肽對AD的藥用價值。通過對AD的兩種細胞模型的保護作用研究顯示,具有藥理活性的RJP來源于MRJP1。利用高性能液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)對具有藥理活性的RJP進行結(jié)構(gòu)的初步分析,為研制具有預防和治療AD功能的天然藥物提供物質(zhì)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：主要王漿蛋白1 蜂王漿多肽 阿爾茲海默癥 反相高壓液相色譜 液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)
【學位授予單位】：山東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一章 綜述10-21
• 1 主要王漿蛋白及多肽的簡介10-14
• 1.1 水溶性主要王漿蛋白MRJPs家族概述10
• 1.2 主要王漿蛋白家族成員的研究概況10-12
• 1.3 MRJPs的生物學功能12-13
• 1.4 蜂王漿多肽的生物學功能13-14
• 2 主要王漿蛋白及多肽的分離純化的研究現(xiàn)狀14-16
• 2.1 MRJPs的分離純化14-15
• 2.2 多肽類的分離15-16
• 2.3 蛋白質(zhì)及多肽的質(zhì)譜鑒定16
• 3 阿爾茲海默癥發(fā)病機制的研究進展16-18
• 3.1 阿爾茲海默癥的簡介16-17
• 3.2 β 淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）級聯(lián)假說17
• 3.3 用于研究AD的細胞模型17-18
• 3.4 阿爾茲海默癥的治療現(xiàn)狀18
• 4 主要王漿蛋白治療阿爾茲海默癥的潛力18-19
• 4.1 蜂王漿對神經(jīng)細胞具有神經(jīng)營養(yǎng)和促進分化的作用18-19
• 4.2 蜂王漿對阿爾茲海默癥有較好的防治和緩解作用19
• 5 本論文的研究內(nèi)容及目的意義19-21
• 第二章 蜂王漿混合多肽的制備21-34
• 1 材料與方法21-27
• 1.1 材料21-22
• 1.2 儀器22
• 1.3 方法22-27
• 1.3.1 水溶性主要王漿蛋白（WSRJ）溶液的制備22-23
• 1.3.2 主要王漿蛋白MRJP1的親和層析23-24
• 1.3.3 主要王漿蛋白MRJP1的離子交換層析24-25
• 1.3.4 主要王漿蛋白MRJP1的LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定25
• 1.3.5 主要王漿蛋白MRJP1的胰蛋白酶酶解25-26
• 1.3.6 分子量為 0-3 kDa的蜂王漿混合多肽的分離制備26
• 1.3.7 分子量為 0-3 kDa蜂王漿混合多肽的四個組份的制備26-27
• 2 結(jié)果與分析27-32
• 2.1 主要王漿蛋白MRJP1親和層析結(jié)果27-28
• 2.2 主要王漿蛋白MRJP1的離子交換層析結(jié)果28-29
• 2.3 主要王漿蛋白MRJP1的LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定29
• 2.4 蜂王漿MRJP1的胰蛋白酶酶解結(jié)果29-30
• 2.5 混合多肽組份的分析制備30-32
• 3 討論32-34
• 第三章 有效成份的細胞活性檢測及結(jié)構(gòu)的初步分析34-47
• 1 材料與方法34-38
• 1.1 材料34
• 1.2 儀器34-35
• 1.3 方法35-38
• 1.3.1 MTT法測定RJP對SH-SY5Y細胞的保護作用35
• 1.3.2 Aβ ELISA測定RJP對N2a/APP695sw細胞的保護作用35-37
• 1.3.3 Q-Exactrve LC-MS/MS對寡肽的分子量及氨基酸序列分析37-38
• 1.3.4 統(tǒng)計學方法38
• 2 結(jié)果與分析38-44
• 2.1 MTT法測定RJP對SH-SY5Y細胞的保護作用38-41
• 2.2 細胞形態(tài)學觀察RJP對誘導損傷的SH-SY5Y細胞的作用41-42
• 2.3 Aβ ELISA測定RJP對N2a/APP695sw細胞的保護作用42-43
• 2.4 Q-Exactrve LC-MS/MS對寡肽的分子量及氨基酸序列分析43-44
• 3 討論44-47
• 第四章 全文總結(jié)47-49
• 參考文獻49-55
• 附錄1 圖表目錄55-56
• 附錄2 英文縮寫說明56-57
• 附錄3 RJP的質(zhì)譜數(shù)據(jù)57-58
• 致謝58

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李茹;宋瑋;喬雪;劉佳;梁鴻;葉敏;;高效液相色譜和Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用鑒定半枝蓮的化學成分（英文）[J];Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences;2015年10期

2 陳亞玲;張晶;;蜂王漿的研究進展[J];食品研究與開發(fā);2015年02期

3 李玫璐;譚量量;裘衛(wèi);尹志紅;沈立榮;;蜂王漿主蛋白(MRJPs)超濾分離工藝優(yōu)化及產(chǎn)物質(zhì)量分析[J];浙江大學學報(農(nóng)業(yè)與生命科學版);2014年05期

4 胡海燕;金國琴;張學禮;許言午;夏花英;鄭靜;;中藥對Aβ_(25-35)損傷的SH-SY5Y細胞的保護作用[J];上海中醫(yī)藥大學學報;2013年05期

5 郭延壘;吳明軍;李文娟;江崢;葉芳挺;于超;;Q Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)對丹皮酚經(jīng)大鼠肝微粒體體外代謝產(chǎn)物的分析[J];分析化學;2013年07期

6 胡熠凡;陳忠周;田文禮;趙亞周;彭文君;;蜂王漿中主蛋白成分(MRJP2)的分離純化及圓二色譜分析[J];食品科學;2013年23期

7 魯碧楠;許麗娜;韓旭;彭金詠;;蛋白質(zhì)分離分析中的色譜技術(shù)新進展[J];中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學;2009年S1期

8 吳思緲;周黎明;;阿爾茨海默病的發(fā)病機制及藥物治療的進展[J];四川生理科學雜志;2009年01期

9 侯佳寧;胡雅兒;;阿爾茨海默病淀粉樣肽級聯(lián)假說及其相關(guān)基因研究進展[J];神經(jīng)解剖學雜志;2009年01期

10 陳貫虹;遲建國;邱維忠;王加寧;孫元軍;;多肽藥物的研究進展[J];山東科學;2008年03期

，

本文編號：845406